賀 雪,殷佩浩

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院普外科,上海 200062

結(jié)直腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年上升[1]。研究表明,microRNA表達(dá)失調(diào)是腫瘤普遍特征,可作為檢測腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物[2-4]。miR-21是結(jié)直腸癌組織中最常見的過表達(dá)microRNA之一[5],以“癌基因”身份參與結(jié)直腸癌發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等重要過程。本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后血清miR-21表達(dá)變化,并與正常人血清 miR-21水平對(duì)比,探討血清miR-21表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者的臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)

按中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)政司制定的《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn),全部病例均經(jīng)手術(shù)病理確診。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版結(jié)直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)收集高危Ⅱ～Ⅲ期患者。高危Ⅱ期的高危因素包括腫瘤分化3～4級(jí)、淋巴管/血管浸潤、腸梗阻、檢出淋巴結(jié)<12個(gè);或T4N0M0;或T3伴局部穿孔或接近切緣、切緣不確定或切緣陽性;Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌TNM分期參照UICC。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡為18～80歲,性別不限;(2)經(jīng)影像及血液檢查診斷為可手術(shù)結(jié)直腸癌;(3)均為結(jié)直腸癌根治手術(shù)后病例;(4)符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn),有明確的病理、細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果;(5)TNM分期為高危 Ⅱ、Ⅲ 期;(6)入組時(shí)未經(jīng)過化療、無明確復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移;(7)預(yù)計(jì)生存期>6個(gè)月;(8)卡氏(Karnofsky)評(píng)分≥70分;(9)無嚴(yán)重心、肝、腎、造血系統(tǒng)疾患,化療禁忌證及其他影響藥物;(10)自愿參加本試驗(yàn)并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)不符合上述入選標(biāo)準(zhǔn)者;(2)已行化、放療等治療者;(3)已有腹腔、肝臟的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者;(4)有明顯心(冠心病、心肌梗死等嚴(yán)重心臟疾病史)、肝(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯異常)、 腎(慢性腎臟病分期>2 期)等功能損害,或精神病患者、孕婦或哺乳期婦女;(5)過敏體質(zhì)或?qū)Χ喾N藥物過敏者。

剔除標(biāo)準(zhǔn):(1)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)不符合病理選擇標(biāo)準(zhǔn)者;(2)用藥過程中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)如肝腎功能異常等或某些合并癥、并發(fā)癥及不宜繼續(xù)接受治療者;(3)用藥過程中,因非藥物因素而患其他疾病不能繼續(xù)治療者;(4)未按規(guī)定用藥、無法判斷療效,或資料不全等影響療效或安全性判斷者;(5)因其他因素而自行退出試驗(yàn)者。

1.2 臨床資料

根據(jù)上述納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn),選取2016年6月至2018年3月上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院普外科收治的結(jié)直腸癌患者33例;另選取同期本院體檢的健康志愿者20例為對(duì)照組。均簽署知情同意書,愿意配合血標(biāo)本采集和隨訪。33例結(jié)直腸癌中,男19例,女14例,年齡(65.64±8.89)歲;結(jié)腸癌27例,直腸癌6例;低分化8例,中分化25例;高危Ⅱ期15例,Ⅲ期18例。對(duì)照組志愿者,男12例,女8例,年齡(63.25±4.08)歲。兩組性別、年齡無差異,具可比性。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.3.1 血標(biāo)本采集、處理

分別采集結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后1周和健康志愿者體檢當(dāng)日清晨空腹外周靜脈血5 mL。常溫下4 h內(nèi)全血離心(4 ℃、1 200 r/min);離心得血清0.5～1 mL,收集于EP管中,編號(hào)后凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 RT-PCR檢測

應(yīng)用MiRCURY RNA Isolation Kit(丹麥Exiqon公司)提取血清總miRNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得cDNA,以U6為內(nèi)參,采用RT-PCR儀(ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀,美國ABI公司)對(duì)miR-21進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列見表1。miR-21反應(yīng)體系為:miRNA特異引物(10 μmol/L) 0.5 μL,mRQ 3′引物0.5 μL,SYBR Advantage Premix(2×) 12.5 μL,ROX Dye(50×) 0.5 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 9 μL,共25 μL。U6反應(yīng)體系為:U6正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,U6反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,SYBR Advantage Premix(2X) 12.5 μL,ROX Dye(50X) 0.5 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 9 μL,共25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 s變性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s;定量PCR×40個(gè)循環(huán);95 ℃ 60 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s解離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)入Excel表中進(jìn)行分析和計(jì)算,Ct值是反映管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)規(guī)定值時(shí)所歷經(jīng)的循環(huán)數(shù)目,ΔCt等于miR-21的Ct值與內(nèi)參基因U6的Ct值的差值。運(yùn)用2-ΔCt方法得出miR-21相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用t檢驗(yàn);分類資料用頻數(shù)(百分比)表示,采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸癌患者和健康志愿者血清miR-21

33例結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清miR-21相對(duì)表達(dá)量明顯高于20例健康志愿者血清miR-21相對(duì)表達(dá)量(5.05±0.96對(duì)0.79±0.14,P<0.05),見表2。

分組例數(shù)miR-21t值P值健康者200.79±0.14腸癌335.05±0.964.406<0.001

2.2 腸癌患者手術(shù)前后血清miR-21

33例結(jié)直腸癌患者術(shù)后血清miR-21相對(duì)表達(dá)量明顯低于術(shù)前血清miR-21相對(duì)表達(dá)量(1.38±0.15對(duì)5.05±0.96,P=0.001),見表3。

分組例數(shù)miR-21t值P值術(shù)前335.05±0.96術(shù)后331.38±0.153.8040.001

3 討論

鑒于結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率逐年上升,臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期,手術(shù)和/或術(shù)后放化療后仍有30%～50%患者死于腫瘤復(fù)發(fā),因此有必要尋找有效的結(jié)直腸癌標(biāo)志物以助于早期確診并預(yù)測療效[6]。

MicroRNA作為一種特殊的遺傳物質(zhì)一直受到學(xué)術(shù)界的重視。它是一類小分子非編碼單鏈RNA,長度約22個(gè)核苷酸左右。研究表明,microRNA異常表達(dá)或失調(diào)是腫瘤組織的普遍特征。miR-21是較早被發(fā)現(xiàn)且公認(rèn)的致癌性microRNA,是實(shí)體腫瘤(包括結(jié)直腸癌)中最常見的過高表達(dá)microRNA之一[7]。文獻(xiàn)報(bào)道,miR-21在結(jié)直腸癌患者組織、血清、糞便樣本中均過表達(dá)[8-9]。本研究中結(jié)直腸癌患者血清miR-21相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康志愿者,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致;且術(shù)后結(jié)直腸癌患者血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平較術(shù)前顯著降低。提示,血清miR-21高表達(dá)可作為結(jié)直腸癌診斷和療效預(yù)測的標(biāo)志物,有潛在臨床價(jià)值?；赑CR技術(shù)miRNA檢測具有操作簡單、價(jià)格低廉、診斷靈敏等特征,而目前又無結(jié)直腸癌miRNA檢測試劑盒,我們相信,深入探討結(jié)直腸癌miR-21檢測試劑盒具有一定研究前景。

目前,血清miR-21具體來源仍不明了。有學(xué)者推測,血清miR-21可能是由腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡后細(xì)胞內(nèi)miRNA主動(dòng)釋放至血液中所致[10]。手術(shù)切除腫瘤后miR-21明顯下降可能提示血清miR-21與腫瘤組織分泌相關(guān)。