侯宇,廖芬芳,劉漫宇,王偉章

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室,廣東 廣州 510006)

費城染色體陽性(philadelphia chromosome positive,Ph+)急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最致命的白血病,約占成年人ALL患者的20%以及老年ALL患者的50%[1]。盡管酪氨酸激酶抑制劑改善了這一惡性疾病的預(yù)后,但仍然不能徹底治愈該疾病。因此,探索新的Ph+ALL治療方法仍然十分必要。原癌基因c-myc在細(xì)胞增殖、凋亡和分化過程中起著重要的調(diào)控作用,其異常表達(dá)在包括ALL在內(nèi)的多種人類腫瘤中屢見不鮮[2]。c-myc蛋白也因此成為了許多腫瘤包括淋巴瘤和白血病治療的潛在藥物靶點[3]。然而,迄今為止c-myc小分子抑制劑抗Ph+ALL的研究卻鮮有報道。因此,本研究擬采用c-myc的小分子抑制劑10058-F4作用于Ph+ALL細(xì)胞株Sup-B15和原代Ph+和Ph-ALL細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡,以及Western bloting檢測c-myc及其下游調(diào)控基因蛋白的表達(dá),初步探討10058-F4抗Ph+ALL的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) Sup-B15細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含20%(φ)胎牛血清(美國Gibco公司)的IMDM培養(yǎng)液(美國Gibco公司))中,置于5%(φ)CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。ALL患者骨髓樣品經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離獲取白細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中。

1.1.2 一般資料 ALL患者的骨髓樣品收集于廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,均確診為Ph+和Ph-初發(fā)患者,且未接受放、化療,2名患者均為女性。

1.1.3 主要儀器 FACScalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司) 。

1.1.4 主要試劑 格列衛(wèi)(imatinib mesylate,IM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自美國Sigma公司；PPP和10058-F4購自selleck公司；c-myc、Mcl-1、Bcl-2和Bcl-xl購自美國abcam公司；Bcl-abl、GAPDH、Bcr-abl、p-crkl、辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗兔和羊抗小鼠IgG抗體購自美國CST公司；Bax抗體購自武漢博士德公司；凋亡試劑盒購自美國Biolegend公司；ECL購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞周期檢測 以終濃度為20、40和60 μmol/L的10058-F4和5.0 μmol/L的IM處理Sup-B15細(xì)胞不同時間(6、12、24 h) 后,收集細(xì)胞,1×PBS潤洗細(xì)胞2次,-20 ℃預(yù)冷70%(φ)乙醇固定過夜。上機(jī)前樣品用1×PBS潤洗2次,1×PBS 100 μL重懸細(xì)胞并加入RNA酶2 μL,于37 ℃條件下孵育15 min,再以1×PBS潤洗,1×PBS 100 μL重懸細(xì)胞,加入PI 5 μL,室溫避光孵育5 min,最后加入1×PBS至500 μL體積,混勻后上機(jī)檢測。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測 以終濃度為20、40和60 μmol/L的10058-F4處理Sup-B15細(xì)胞48 h和72 h。原代ALL細(xì)胞經(jīng)40 μmol/L的10058-F4處理72 h。處理完成后收集細(xì)胞,冰育PBS潤洗2次,離心去上清,加入1×binding buffer 100 μL 重懸,再加入Alexa Flour 647 Annexin-V 試劑4 μL,混勻,室溫避光孵育10 min。再加入PI 7 μL,最后加入1×binding buffer 200 μL調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每毫升1×106,上機(jī)檢測。

1.2.3 Western blotting分析 不同濃度的PPP(0.5、1.0和5.0 μmol/L)、10058-F4(20和40 μmol/L)和5.0 μmol/L的IM處理細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞并提取蛋白。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,冰上濕轉(zhuǎn)1.5 h至PVDF膜,室溫條件下5%脫脂奶粉封閉2 h,加入含5% BSA稀釋液稀釋的c-myc、Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-abl、GAPDH、Bcr-abl和p-crkl抗體(1∶1 000),4 ℃過夜,加入稀釋的相應(yīng)二抗 (1∶5 000),室溫孵育1 h。洗膜后用ECL solution顯色,最后進(jìn)行顯影,定影。

2 結(jié)果

2.1 c-myc抑制劑10058-F4對Sup-B15細(xì)胞凋亡的影響

20、40和60 μmol/L的10058-F4處理Sup-B15細(xì)胞48 h和72 h后,20 μmol/L的10058-F4對細(xì)胞凋亡無明顯影響,而40、60 μmol/L的10058-F4均顯著地誘導(dǎo)Sup-B15細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖1)。

2.2 c-myc抑制劑10058-F4對Sup-B15細(xì)胞周期的影響

不同濃度的10058-F4以及5 μmol/L的IM處理細(xì)胞6、12、24 h后對細(xì)胞周期均無明顯影響(圖2)。

2.3 c-myc抑制劑10058-F4對c-myc及其下游調(diào)控基因蛋白表達(dá)的影響

20、40 μmol/L的10058-F4處理細(xì)胞24 h后,20 μmol/L的10058-F4對c-myc、Bcl-2、Bax、Bcl-abl和p-crkl蛋白表達(dá)均無明顯影響,而對Bcl-xl和Mcl-1的蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用(圖3)。40 μmol/L的10058-F4對Bcl-2、Bax和p-crkl蛋白表達(dá)均無明顯影響,而對c-myc、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-abl具有明顯的抑制作用。作為陽性對照,不同濃度的PPP(0.5、1.0、5.0 μmol/L)均顯著抑制c-myc、Bcl-2、Mcl-1和p-crkl蛋白的表達(dá),而對Bcl-xl、Bax和Bcr-abl的蛋白表達(dá)無明顯影響。5 μmol/L的IM顯著抑制c-myc、Mcl-1和p-crkl蛋白的表達(dá),對Bcl-xl、Bcl-2、Bax和Bcr-abl的蛋白表達(dá)無明顯影響。

1. DMSO； 2.10058-F4 20 μmol/L； 3. 10058-F4 40 μmol/L； 4. 10058-F4 60 μmol/L。與溶劑對照組(DMSO)比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測10058-F4對細(xì)胞凋亡的影響

Figure1Effect of 10058-F4 on cell apoptosis by flow cytometry

1. DMSO； 2. 10058-F4 20 μmol/L； 3. 10058-F4 40 μmol/L； 4. 10058-F4 60 μmol/L； 5. IM 5 μmol/L。

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測10058-F4和IM對細(xì)胞周期的影響

Figure2Effect of 10058-F4 and IM on cell cycle distribution by flow cytometry

1. DMSO； 2. PPP 0.5 μmol/L； 3. PPP 1.0 μmol/L； 4. PPP 5 μmol/L； 5. 10058-F4 20 μmol/L； 6. 10058-F4 40 μmol/L； 7. IM 5 μmol/L。

圖3Western blotting檢測PPP、10058-F4和IM對c-myc、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bax、Bcl-abl和p-crkl蛋白表達(dá)的影響

Figure3Effect of PPP,10058-F4 and IM on protein expression of c-myc,Bcl-2,Bcl-xl,Mcl-1,Bax,Bcl-abl andp-crkl by western blotting

2.4 10058-F4對Ph+和Ph-的原代ALL細(xì)胞死亡的影響

40 μmol/L的10058-F4處理Ph+和Ph-的原代ALL細(xì)胞72 h后,Ph+的原代ALL細(xì)胞凋亡率(AV+)顯著提高,而細(xì)胞壞死率(PI+)無明顯變化；Ph-的原代ALL細(xì)胞壞死率(PI+)顯著提高,而細(xì)胞凋亡率(AV+)無明顯變化(圖4)。

與溶劑對照組(DMSO)比較：**P<0.01。

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測10058-F4對細(xì)胞死亡的影響
Figure4Effect of 10058-F4 on cell death by flow cytometry

3 討論

以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),c-myc的高表達(dá)在白血病發(fā)生過程中起關(guān)鍵的作用[4],抑制c-myc能夠阻止白血病的發(fā)生[5]。同時,越來越多的證據(jù)也顯示,c-myc抑制劑在多種腫瘤中均顯示出很強(qiáng)的抗癌活性。本研究發(fā)現(xiàn),c-myc抑制劑10058-F4在誘導(dǎo)Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡同樣非常有效,提示10058-F4具有治療 Ph+ALL的潛能。

10058-F4是一種通過阻斷c-myc和MAX的二聚化而抑制c-myc反式激活活性的c-myc抑制劑。研究發(fā)現(xiàn),在不同的腫瘤類型中它可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。在AML細(xì)胞中,10058-F4通過抑制c-myc蛋白表達(dá),上調(diào)CDK抑制蛋白p21和p27使AML細(xì)胞停滯在G0/G1期。同時,10058-F4通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)以及上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,10058-F4也通過激活多種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)AML骨髓細(xì)胞分化[6]。而在腎癌細(xì)胞中,10058-F4明顯降低線粒體氧化磷酸化蛋白(NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COXIV、OSCP)的表達(dá),引起線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生明顯增高,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。10058-F4除了自身具有抗腫瘤活性外,還能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞[8]和胰腺導(dǎo)管腺癌[9]對常規(guī)化療藥物的敏感性,以及逆轉(zhuǎn)CML細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥性[10]。這些研究成果表明,10058-F4具有較為廣泛的抗腫瘤活性。以往的研究已經(jīng)提示,c-myc是Ph+ALL潛在的治療靶點[11]。因此,本研究通過10058-F4進(jìn)一步研究c-myc在Ph+ALL細(xì)胞中的作用及其機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),低濃度10058-F4(20 μmol/L)對Sup-B15細(xì)胞凋亡無明顯影響,同時對c-myc、Bcl-2和Bcl-xl亦無抑制作用,但能夠抑制Mcl-1蛋白的表達(dá)；而高濃度10058-F4(40 和60 μmol/L)顯著地誘導(dǎo)Sup-B15細(xì)胞凋亡,同時也明顯地抑制c-myc、Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1的蛋白表達(dá),提示10058-F4促進(jìn)Sup-B15細(xì)胞的凋亡與抑制c-myc調(diào)控的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)相關(guān),而與Mcl-1的表達(dá)抑制無關(guān)。此外,本研究也發(fā)現(xiàn),與Bcr-abl靶向藥物IM相比,10058-F4能夠抑制Bcr-abl蛋白的表達(dá),但對其下游靶蛋白crkl的磷酸化無影響,這與IM的作用機(jī)制明顯不同。鑒于Bcr-abl對于Ph+細(xì)胞生存的關(guān)鍵作用,抑制Bcr-abl蛋白的表達(dá)可能是10058-F4發(fā)揮抗Ph+ALL作用的一種全新的分子機(jī)制,但其抑制Bcr-abl表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制仍有待深入的研究。

綜上所述,本研究初步探討了10058-F4抗Ph+ALL的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制,為將10058-F4開發(fā)成為治療Ph+ALL藥物提供理論依據(jù)。