吳合亮 李美辰 潘靖丹 邵薪諾 李世昌 王一諾 杜孌英

承德醫(yī)學(xué)院，河北省承德市 067000

肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌總數(shù)80%～85%。在過去十年中，由于人口老齡化、吸煙、環(huán)境污染(廚房油煙、煤炭燃燒、汽車尾氣)等因素，其死亡率有所上升[1-2]。然而大多數(shù)肺癌只有在晚期才能明確診斷，5年生存率低于15%，預(yù)后較差[3-4]。以鉑類為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化療方案仍是晚期肺癌主要治療方法，但有明顯的不良反應(yīng)，且易復(fù)發(fā)[5-6]。相比之下，生物療法被認(rèn)為是一種安全、有效的治療方法。已有研究表明，旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白體外作用于某些腫瘤細(xì)胞能使其增殖受到抑制，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。本研究以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞作為研究對象，觀察了旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白對A549細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲、實驗動物和細(xì)胞株 實驗所用旋毛蟲為豬源旋毛蟲，由本教研室保種。實驗動物為清潔型健康成年昆明小鼠，體重18～32g，購自承德醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購自上海北諾生物科技有限公司。

1.2 實驗試劑 MTT、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海索萊寶生物科技有限責(zé)任公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液(0.25%)購自美國Gibco公司；氯化鈉購自天津市百世化工有限責(zé)任公司。

1.3 旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白的制備及定量 體外提取旋毛蟲肌幼蟲，經(jīng)過純水多次洗滌沉淀后，用4%的明膠作為佐劑，對旋毛蟲進行計數(shù)，調(diào)整蟲體密度約為3 000條/ml,每只小鼠經(jīng)口灌服0.1ml含旋毛蟲肌幼蟲的明膠，保蟲35d后，采用頸椎離斷法處死，去其四肢、內(nèi)臟、脂肪等。取其肌肉，先用純水多次洗滌，用干凈的剪刀剪成小塊狀，再置于粉碎機內(nèi)攪碎，加入1.5%的胃蛋白酶和1.5%的鹽酸，于37℃恒溫水浴鍋中消化3～4h后，加入0.9%NaCl終止消化，100目無菌銅網(wǎng)過濾沉淀45min，去掉肉液，用生理鹽水多次洗滌，獲取旋毛蟲肌幼蟲。將純凈的旋毛蟲肌幼蟲移入含青鏈霉素的無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，選擇無污染、死蟲率<5%的培養(yǎng)皿收集上清液(旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白)，4℃、12 000g離心30min，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量，-80℃保存。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代 在液氮中取出裝有A549細(xì)胞的凍存管，置于37℃恒溫水浴鍋中快速完全消融，避免結(jié)晶傷害細(xì)胞。解凍后將凍存管置于離心機中離心，在超凈臺中小心棄掉凍存液。往凍存管中加入0.5ml RPMI1640培養(yǎng)基(含10%血清和1%青鏈霉素混合液)，重新懸浮細(xì)胞，吹打混勻后移入60mm培養(yǎng)皿，補加2.5ml培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長到培養(yǎng)皿的90%～95%，進行細(xì)胞傳代。三代后，將對數(shù)期細(xì)胞分為三組：實驗組(加入不同濃度ESPs)、陽性對照組(加入不同濃度的DDP)和陰性對照組(加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基)。

1.5 MTT法檢測A549細(xì)胞增殖活性 收集對數(shù)期的A549細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5×103個細(xì)胞。實驗組為3種濃度：0.3mg/ml、0.15mg/ml、0.075mg/ml，陽性對照組為3種濃度：6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml，陰性對照組加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基。每個濃度設(shè)為5個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，棄掉用過的培養(yǎng)基。實驗組每孔加入相應(yīng)濃度的ESPs 200μl，陽性對照組每孔加入相應(yīng)濃度的DDP 200μl，陰性對照組加入200μl無血清RPMI1640培養(yǎng)基。三組分別培養(yǎng)24h、36h和48h后，每孔補加20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄上清，每孔加入150μl DMSO，振板10min,通過酶標(biāo)儀測定吸光度OD值，計算不同處理方法對細(xì)胞的抑制率。抑制率=(1-實驗組OD值或陽性對照組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)比較均值，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

ESPs和DDP對A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，并隨著劑量的增加和時間的延長，抑制率也在上升，呈現(xiàn)出劑量—時間效應(yīng)。與陰性對照組比較，不同濃度的ESPs和不同濃度的DDP均有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。與陽性對照比較，0.30mg/ml、0.15mg/ml、0.075mg/ml ESPs組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，見表1、2。

表1不同濃度旋毛蟲排泄分泌蛋白對A549細(xì)胞抑制率

注：與陰性對照組比較，*P<0.05。

表2不同濃度順鉑對A549細(xì)胞抑制率

注：與陰性對照組比較，*P<0.05。

3 討論

旋毛蟲是一種腸道線蟲，感染幾乎所有哺乳動物，包括人類。人或動物可通過食入含有活的囊包幼蟲的肉類或其制品而引起旋毛蟲病[8]。該線蟲的幼蟲和成蟲寄生在同一宿主體內(nèi)，主要有3個階段可以產(chǎn)生抗原：肌幼蟲(ML)期、成蟲(AD)期和新生幼蟲(NBL)期。但由于其寄生與寄生時間的不同，肌幼蟲較成蟲和新生幼蟲更易獲取，故選擇肌幼蟲作為研究對象[9-10]。旋毛蟲蟲體蛋白或抗原根據(jù)來源的不同，可分為排泄分泌蛋白(抗原)、表面蛋白(抗原)和蟲體蛋白(抗原)[11]。已有研究表明旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白能夠抑制小細(xì)胞肺癌、纖維瘤、肝癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、骨髓瘤、乳腺癌等惡性腫瘤的生長，并能誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[12-15]。

本研究以旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(ESPs)為實驗組，順鉑(DDP)為陽性對照組和不加處理的細(xì)胞為陰性對照組，通過MTT比色法檢測ESPs和DDP對A549細(xì)胞增殖活性的影響。實驗結(jié)果表明，ESPs和DDP均能抑制A549細(xì)胞的增殖，旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白隨著藥物濃度的倍比增大，抑制率逐漸增大，濃度為0.075mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml的排泄分泌蛋白于48h抑制率分別達18.63%、23.59%、36.32%，同時隨著作用時間的延長，抑制率也在上升，具有劑量—時間效應(yīng)。由于DDP具有毒副作用，且易出現(xiàn)二次耐藥。因此，ESPs有可能成為未來的靶向治療藥物，實驗為尋找抗腫瘤藥物提供了新設(shè)想，為腫瘤生物治療提供了實驗依據(jù)。