高 宇，周耿瑤，方從文，周 健，程 坤，秦緒軍，王 楓

太白楤木（aralia taibaiensis）是秦巴山區(qū)特產(chǎn)的藥用植物，在民間主要用于肝、腎等多種急慢性炎癥的治療，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，皂苷類為其主要的藥理學(xué)作用成分[1]。本課題組較早地對太白楤木成分特別是皂苷的藥理學(xué)作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參皂苷Ⅳa（CHS）的含量豐富，且具有很好的抗氧化以及抗衰老作用[2]。營養(yǎng)過剩引起的重要臟器如肝臟內(nèi)脂肪沉積是多種代謝疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，有大量研究提示，活性氧（ROS）引起的氧化應(yīng)激在此過程中發(fā)揮重要作用[3]。前期本課題已經(jīng)證明CHS具有很好的抗氧化應(yīng)激損傷的作用，本研究采用混合游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02建立體外脂肪肝的細(xì)胞模型，觀察CHS的保護(hù)作用，并從抗氧化應(yīng)激和調(diào)控自噬的角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 CHS購自狄爾格公司（南京）（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS）、高糖 DMEM 培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司；油酸（OA）、棕櫚酸（PA）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）和DCFH-DA染料購自Sigma公司；MitoSOXTM Red線粒體超氧化物檢測試劑盒購自Invitrogen公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自Thermo公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、MDA試劑盒購自碧云天生物公司；ULK1、p-ULK1、AMPK和p-AMPK抗體購自 Cell Signaling Technology公司；LC3抗體購自Novus公司；Tubulin抗體購自Bioworld公司；TG試劑盒購自北京普利萊公司；MDA試劑盒和線粒體分離試劑盒購自凱基生物公司；全波段酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜及成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人肝L-02細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫贈送，采用10%FBS的高糖DMEM，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待長至60%～70%融合，1×105個/孔，接種于 6孔板，。將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組（Control）、FFA 模型組和 10、20、40 μg/ml CHS干預(yù)組。其中對照組給予相同劑量牛血清白蛋白（BSA），F(xiàn)FA 模型組加入終濃度為 400 μmol/L 的FFA（油酸∶棕櫚酸=2∶1），CHS 干預(yù)組分別給予 10、20、40 μg/ml CHS共處理。2 w后收集各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法測定細(xì)胞活力 將L-02細(xì)胞接種96孔板，加入不同濃度的 CHS（5、10、20、40、80 μg/ml）處理24 h，加入終濃度為5 mg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，對照組為相同劑量BSA處理，最后加入DMSO 100 μl，全波段酶標(biāo)儀測定492 nm處吸光值。

1.3.2 細(xì)胞總活性氧（T-ROS）和線粒體活性氧（MROS）測定 各組細(xì)胞采用DCHF-DA染色法測定T-ROS，DCFH-DA 終濃度為 10μmol/L（287810，Sigma）。5%CO2、37℃培養(yǎng)30 min，0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長525 nm處測定熒光強(qiáng)度。線粒體ROS采用MitoSOXTM Red試劑盒，MitoSOXTM工作液加入終濃度為5 μmol/L，5%CO2、37℃培養(yǎng)30 min，0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，激發(fā)光波長510 nm，發(fā)射光波長580 nm處測定熒光強(qiáng)度。

1.3.3 甘油三酯（TG）和丙二醛（MDA）水平測定0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，每孔加入RIPA裂解液200 μl， 充分裂解后，4℃14 000 r/min離心20 min，取上清。試劑盒提取線粒體(23229,Thermo)。BCA試劑盒蛋白定量，試劑盒測定TG（E1003，北京普利萊）和 MDA 水平（KGT004，凱基生物）。

1.3.4 Western blot法測定 LC3、ULK1、AMPK 及相應(yīng)磷酸化蛋白水平 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒定量，取總蛋白15～20 μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，牛奶封閉后加入一抗，4℃搖床孵育過夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜4次，滴加化學(xué)發(fā)光液，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHS對L-02細(xì)胞活力的影響 MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量CHS組與對照組細(xì)胞活力比較無顯著差異（P＞ 0.05，圖 1）。

圖1 各組L-02細(xì)胞活力檢測結(jié)果

2.2 CHS對FFA處理引起的細(xì)胞T-ROS和MROS水平的影響 T-ROS和M-ROS檢測結(jié)果表明，F(xiàn)FA處理可以顯著提高T-ROS和M-ROS水平，而CHS可以有效抑制FFA引起的T-ROS和M-ROS水平升高，并呈一定的量效關(guān)系（圖2）。

圖2 CHS對FFA誘導(dǎo)L-02細(xì)胞T-ROS和M-ROS水平的影響

2.3 CHS對FFA處理引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物及TG水平的影響 MDA變化趨勢與ROS變化趨勢相一致，F(xiàn)FA處理可以顯著增加細(xì)胞整體和線粒體的MDA的水平，而CHS能夠有效抑制MDA水平升高。與此同時，F(xiàn)FA處理可以顯著提升TG水平，CHS也可以顯著降低FFA引起的TG水平的增加，并且也呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。見表1。

2.4 CHS對FFA抑制細(xì)胞自噬水平及AMPK/ULK1通路的影響 Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA處理能夠顯著抑制LC3II的水平，而給與不同劑量CHS可以明顯提高LC3II的水平。FFA處理可以顯著抑制ULK1的Ser555的磷酸化及上游的AMPK的Thr172磷酸化水平，而不同劑量CHS可以顯著提高ULK1和AMPK的磷酸化水平。見圖3。

3 討論

脂肪肝是臨床常見病和多發(fā)病，也是肝硬化、肝癌等惡性肝臟疾病發(fā)病的危險因素，因此，防治脂肪肝的意義重大[4]。有研究表明，在由營養(yǎng)過剩引起的脂肪肝發(fā)生、發(fā)展中，氧化應(yīng)激扮演了重要角色[5-6]，因此，有效抑制ROS的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激，是防治脂肪肝的潛在重要策略之一。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，太白楤木皂苷中的重要成分CHS具有很好的抗氧化作用[2]，因此推測，CHS可能具有防治脂肪肝的作用。L-02細(xì)胞是人正常肝細(xì)胞，是理想的降脂研究體外細(xì)胞模型。因此本研究采用混合游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02建立體外脂肪肝的細(xì)胞模型，觀察CHS的保護(hù)作用。首先本課題進(jìn)行了CHS劑量篩選實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5～80 μg/ml劑量范圍的CHS對L-02細(xì)胞增殖及活力無顯著影響，因此，后續(xù)實驗選用了 10、20 和 40 μg/ml 3 個劑量。本課題采用經(jīng)典的FFA處理建立體外脂肪肝的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)CHS濃度在3個劑量下，可以有效降低FFA引起的細(xì)胞ROS水平。而線粒體是細(xì)胞內(nèi)源性ROS的最主要來源[7]。CHS干預(yù)可有效降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和TG含量，提示CHS很可能通過抑制線粒體ROS水平，從而降低細(xì)胞整體ROS水平，減輕相應(yīng)的氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗FFA誘導(dǎo)脂肪沉積的作用。

研究表明，代謝性疾病如脂肪肝等脂肪堆積過程中的脂代謝紊亂與自噬障礙密切相關(guān)，激活自噬能夠改善脂代謝紊亂[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA可以顯著抑制L-02細(xì)胞自噬經(jīng)典標(biāo)志物L(fēng)C3II的水平，表明FFA可以顯著抑制自噬水平，而CHS處理提高LC3II水平的作用存在一定量效關(guān)系，即LC3II含量隨CHS濃度增加而升高。AMPK/ULK1是調(diào)控自噬的重要通路，ULK1也被稱為Atg1，是啟動自噬過程中的重要因子之一，它的活性依賴于其Ser555位點的磷酸化水平，而在ULK1上游主要依賴于AMPK的激活[9]。在本研究中，F(xiàn)FA處理可以顯著抑制ULK1的激活；而不同劑量CHS可以有效拮抗FFA對AMPK的抑制作用，進(jìn)而提高ULK1的磷酸化水平激活自噬。提示FFA可以通過抑制AMPK/ULK1通路抑制自噬，而CHS可以通過激活A(yù)MPK/ULK1通路激活自噬，改善脂質(zhì)沉積，從而發(fā)揮抗FFA誘導(dǎo)的脂肪沉積。

綜上所述，CHS可以通過減輕線粒體氧化應(yīng)激，激活A(yù)MPK/ULK1通路提高自噬，改善FFA引起的脂肪沉積。本研究僅以L-02細(xì)胞脂肪肝模型為基礎(chǔ)，研究了CHS抗FFA誘導(dǎo)的脂肪沉積的作用，其具體機(jī)制和臨床應(yīng)用效果還有待于進(jìn)一步體內(nèi)實驗及臨床驗證。

表1 CHS對FFA引起的細(xì)胞T-MDA、M-MDA和TG水平的影響（n=6）

圖3 CHS對FFA誘導(dǎo)L-02細(xì)胞LC3及AMPK/ULK1通路蛋白影響