劉倩霞，劉 東，張 俊，王 嬌，何興芬，楊富民*，趙保堂*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牦牛乳與其他牛乳相比，其營(yíng)養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖等含量較高[1]。曲拉是牧民將牦牛乳采用簡(jiǎn)單方法脫脂后，在自然條件下微生物發(fā)酵產(chǎn)酸[2]，使酪蛋白凝固、結(jié)塊、風(fēng)干后的產(chǎn)品，亦稱為粗奶酪[3]。曲拉除當(dāng)作食物外，主要用于干酪素和酪朊酸鹽等的生產(chǎn)[4]。曲拉干酪素產(chǎn)品通常作為一種天然的食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)改良劑應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[5]，在精細(xì)化工行業(yè)也有廣泛應(yīng)用，如化妝品、合成染料以及香料香精等，也可作為接觸劑、組織改良劑、增光劑等[6]。隨著曲拉干酪素用途的擴(kuò)展，對(duì)于某些特定品質(zhì)和功能，如抗氧化性等的要求也不斷提高。研究表明，選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆舛嚯?，可制備多種生物活性肽，提高產(chǎn)品的附加值[7]。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的抗氧化活性取決于蛋白酶的種類和水解條件，由于酶的特異性，將產(chǎn)生不同的小肽和游離氨基酸。游離氨基酸和肽段的大小、水平和組成的變化影響抗氧化性。大豆蛋白、乳清蛋白、小麥蛋白等不同來(lái)源的蛋白水解物具有良好的抗氧化能力[8-10]，但有關(guān)牦牛曲拉酶解產(chǎn)物抗氧化性的研究報(bào)道較少。為探討甘南夏河藏區(qū)曲拉酶解產(chǎn)物的抗氧化性，以堿性蛋白酶和胰蛋白酶作為水解酶，以水解度為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化2 種蛋白酶酶解曲拉干酪素的條件，通過(guò)測(cè)定酶解產(chǎn)物超氧陰離子自由基、羥自由基清除率等抗氧化性指標(biāo)比較2 種酶酶解曲拉干酪素溶液的抗氧化能力。本研究旨在明確堿性蛋白酶和胰蛋白酶曲拉干酪素酶解液抗氧化性的差異，為曲拉干酪素酶解工藝以及產(chǎn)物的進(jìn)一步利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲拉產(chǎn)自甘肅甘南夏河縣，曲拉干酪素（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90.0%） 甘肅華安生物科技集團(tuán)；2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇（2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol，TRIS）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/mg） 日本Solarbio公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國(guó)Sigma公司；ferrozine 北京中生瑞泰科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759（PC）紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-4A恒溫?cái)嚢杷″?常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；PHS-3C pH計(jì)、精密天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GT10-1型高速臺(tái)式離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 曲拉干酪素酶解

燒杯中加入蒸餾水，預(yù)熱到適宜溫度，取定量的曲拉干酪素加入蒸餾水中，適量NaOH（1 mol/L）溶液助溶，使曲拉干酪素溶解完全，調(diào)節(jié)溶液pH值到設(shè)定值，加入酶，酶解一定時(shí)間（反應(yīng)過(guò)程中保持pH值恒定），反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴20 min滅酶活性，冷卻至常溫后，離心取上清液（4 000 r/min，20 min），冷凍干燥，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 酶解單因素試驗(yàn)

參照鄭志強(qiáng)[10]、張根生[11]等方法略作修改，堿性蛋白酶在酶解溫度50 ℃、曲拉干酪素質(zhì)量濃度60 g/L、pH 8.5、酶添加量140 U/g、酶解時(shí)間3.5 h的條件下；胰蛋白酶在酶解溫度45 ℃、曲拉干酪素質(zhì)量濃度35 g/L、pH 7.5、酶添加量3 000 U/g、酶解時(shí)間2.5 h的條件下，保持其他條件不變，改變其中一個(gè)因素，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。因素設(shè)置：堿性蛋白酶：酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃；曲拉干酪素質(zhì)量濃度分別為30、40、50、60、70 g/L；pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5；酶添加量分別為80、100、120、140、160 U/g。胰蛋白酶：酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃；曲拉干酪素質(zhì)量濃度分別為25、30、35、40、45 g/L；pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；酶添加量分別為1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g。堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解時(shí)間均設(shè)置為0～5.0 h，每0.5 h取樣。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解時(shí)間（X1）、酶解溫度（X2）、酶添加量（X3）和pH值（X4）為影響因素，以水解度作為響應(yīng)值，采用4因素3水平分析方法，設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors with actual and coded levels used in Box-Behnken design

1.3.4 水解度測(cè)定

水解度測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]方法。

1.3.5 抗氧化性的測(cè)定

1.3.5.1 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

參考Li Xican[12]方法：吸取2.0 mL樣品于試管中與2 950 μL Tris-HCl（pH 7.4）溶液和50 μL 5 mmol/L聯(lián)苯三酚混合，快速振蕩，在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定30 s時(shí)的吸光度A1，300 s時(shí)為A2，計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：ΔAs=A2-A1；ΔAb為空白組吸光度，雙蒸水取代樣品。

1.3.5.2 羥自由基清除率的測(cè)定

參考Zhang Yufeng等[13]方法：吸取1.0 mL樣品于試管中，依次向試管內(nèi)加入1.0 mL 1.865 mmol/L鄰二氮菲-乙醇溶液，2.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4），1.0 mL 1.865 mmol/L FeSO4·7H2O和1.0 mL 0.03% H2O2溶液，振蕩均勻，恒溫水?。?7 ℃）反應(yīng)60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度As，計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

式中：Ab為空白組吸光度，雙蒸水取代樣品；An為損傷組吸光度，雙蒸水代替H2O2溶液。

1.3.5.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Tai等[14]方法略作調(diào)整：將2 mL樣品與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-95%乙醇溶液混合，暗處反應(yīng)30 min，3 000 g/min離心15 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算見(jiàn)公式（3）：

式中：As為2 mL樣品與DPPH溶液吸光度；Ac為2 mL樣品與2 mL 95%乙醇溶液吸光度；Ab為2 mL樣品與DPPH-95%乙醇溶液吸光度。

1.3.5.4 還原力的測(cè)定

參考Gu Fenglin等[15]方法。將1 mL樣品與2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）與2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL雙蒸水、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，室溫放置10 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5.5 Fe2+螯合能力的測(cè)定

參考Carrasco-Castilla等[16]方法。將1 mL樣品與0.1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液和3.7 mL雙蒸水預(yù)混合，加入0.2 mL 5 mmol/L ferrozine溶液，3 000 g/min離心5 min，離心后混合物在室溫下放置20 min于562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算見(jiàn)公式（4）：

式中：As為樣品吸光度；Ac為對(duì)照組吸光度，雙蒸水取代樣品。

1.3.5.6 Cu2+螯合能力的測(cè)定

參照Z(yǔ)hu Lijuan等[17]方法，在1 mL樣品中依次加入1 mL 2 mmol/L CuSO4溶液、1 mL中性吡啶溶液、20 μL 0.1%鄰苯二酚紫溶液迅速混勻，室溫放置5 min，于632 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算見(jiàn)公式（5）：

式中：As為樣品組吸光度；Ab為對(duì)照組吸光度，雙蒸水取代樣品。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 1 酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of one-factor-at-a-time experiments

由圖1A1、B1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶在0～3.5 h、胰蛋白酶在0～2.5 h內(nèi)，水解度均呈上升。堿性蛋白酶在3.5 h達(dá)到最大，水解度為24.97%，胰蛋白酶則在2.5 h達(dá)到最大，水解度為12.29%。之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2 種酶的水解度均稍有下降，但變化均不明顯（P＞0.05）。其原因可能是因?yàn)樵诿附獬跗冢捎诿盖形稽c(diǎn)較多，導(dǎo)致水解度上升趨勢(shì)明顯，而隨著酶解時(shí)間不斷延長(zhǎng)，暴露的酶切位點(diǎn)相對(duì)較少，使反應(yīng)速率逐漸下降，反應(yīng)趨勢(shì)減弱。

由圖1A2、B2可知，堿性蛋白酶和胰蛋白酶分別在酶解溫度50、45 ℃以下時(shí)，隨著酶解溫度的升高，水解度均不斷增大。在50、45 ℃時(shí)分別達(dá)到最大，水解度分別為25.15%、13.72%，之后隨著溫度的逐漸升高，水解度略有下降，這是由于溫度升高導(dǎo)致酶失活的結(jié)果。

由圖1A3、B3可知，隨著曲拉干酪素質(zhì)量濃度的增加，水解度整體呈先增大后減小趨勢(shì)，堿性蛋白酶在曲拉干酪素質(zhì)量濃度60 g/L達(dá)到最大，水解度為25.65%，胰蛋白酶在曲拉干酪素質(zhì)量濃度35 g/L時(shí)達(dá)到最大，為12.65%。底物質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的溶質(zhì)含量少，酶與底物反應(yīng)完全，水解度呈增大趨勢(shì)，隨著底物質(zhì)量濃度逐漸增加，酶與底物結(jié)合飽和，同時(shí)由于反應(yīng)體系的流動(dòng)性變差，使反應(yīng)速率降低，水解度稍有下降。

由圖1A4、B4可知，在一定的pH值范圍內(nèi)，水解度呈增加趨勢(shì)，堿性蛋白酶在8.5時(shí)達(dá)到最大，為25.15%，胰蛋白酶在7.5時(shí)達(dá)到最大，為14.05%，但隨著pH值的不斷增加，水解度均有所下降，pH值影響酶與蛋白質(zhì)之間的解離狀態(tài)，要使水解度呈最大值，必須是反應(yīng)體系處于適宜的酸堿環(huán)境，不適宜將會(huì)導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)改變，使部分酶活性降低。

由圖1A5、B5可知，隨著酶添加量的增加，水解度呈上升趨勢(shì)，堿性蛋白酶在酶添加量140 U/g時(shí)，水解度最大，為25.65%；胰蛋白酶在酶添加量3 000 U/g時(shí)，水解度達(dá)到最大，為13.28%。之后隨酶添加量增大，水解度均稍有下降。適宜的酶添加量可與底物充分結(jié)合、反應(yīng)完全，當(dāng)酶添加超量時(shí)，超量部分酶無(wú)法與底物結(jié)合，水解度則基本無(wú)明顯變化。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿性蛋白酶

表 2 堿性蛋白酶響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design with results for optimization of alkaline protease hydrolysis

表 3 堿性蛋白酶二次回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the quadratic regression model for alkaline protease hydrolysis

注：**. P＜0.01，差異極顯著；*. P＜0.05，差異顯著。下同。

利用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)軟件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，結(jié)果見(jiàn)表2。以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、pH值對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得二次回歸方程為：

水解度=25.85+0.23X1+0.036X2-0.015X3+0.31X4-0.41X1X2-0.30X1X3+0.23X1X4-0.22X2X3+1.02X2X4+0.42XX-2.48X2-2.51X2-2.80X2-2.59X2341234

由表3可知，試驗(yàn)所選用的回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P值為0.377 6，不顯著；模型R2Adj為0.921 7，R2=0.960 9，說(shuō)明該模型與實(shí)際相切合，建立較合理，試驗(yàn)誤差小，信噪比15.036大于4。

圖 2 堿性蛋白酶水解度的響應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface plots for alkaline protease hydrolysis

由圖2可以看出，pH值變化對(duì)水解度的影響顯著，酶解溫度和酶添加量的影響不顯著。酶解溫度與pH值之間的交互作用極顯著（P＜0.01），其他因素之間存在一定交互作用，F(xiàn)值越大影響越顯著，響應(yīng)面的梯度曲線曲面彎曲程度大，表示影響越顯著[18]。各因素對(duì)水解度的影響順序?yàn)閄3＜X2＜X1＜X4，與回歸結(jié)果分析相一致。

綜合單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，堿性蛋白酶酶解曲拉干酪素的優(yōu)化工藝參數(shù)為酶解時(shí)間3.84 h、酶解溫度49.84 ℃、酶添加量139.37 U/g、pH 8.54，預(yù)測(cè)值為24.88%，按最優(yōu)條件為堿性蛋白酶酶解時(shí)間3.8 h、酶解溫度49.8 ℃、曲拉干酪素質(zhì)量濃度60 g/L、pH 8.5、酶添加量140 U/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3）得水解度為24.25%。

2.2.2 胰蛋白酶

表 4 胰蛋白酶響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Response surface design with results for trypsin hydrolysis

25 0 0 0 0 13.72 26 0 0 0 0 13.77 27 0 0 0 0 13.96 28 0 0 0 0 13.92 29 0 0 0 0 13.28

胰蛋白酶響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4，胰蛋白酶酶解工藝二次回歸方程為：水解度=13.73-0.24X1-0.32X2-0.058X3+0.062X4-0.46X1X2-1.13X1X3+0.85X1X4+0.10X2X3+0.13X2X4+0.26X3X4-1.68X12-0.43X22-0.38X32-0.52X42。

表 5 胰蛋白酶二次回歸方程模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the quadratic regression model for trypsin hydrolysis

表5表明，試驗(yàn)所選用的模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P值為0.644 7，不顯著；模型R2Adj為0.942 4，R2=0.971 2，說(shuō)明該模型試驗(yàn)誤差小，擬合程度較好，信噪比19.289大于4。

圖 3 胰蛋白酶水解度的響應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface plots for trypsin hydrolysis

由圖3可見(jiàn)，交互項(xiàng)（X1X2、X1X3、X1X4）對(duì)水解度影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)（X2X3、X2X4、X3X4）影響均不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)（X22、X32、X42）對(duì)水解度的影響極顯著（P＜0.01），各因素對(duì)水解度的影響順序?yàn)閄3＜X4＜X1＜X2。

綜合以上單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，胰蛋白酶優(yōu)化工藝參數(shù)為酶解時(shí)間2.53 h、酶解溫度47.79 ℃、酶添加量2 882.00 U/g、pH 7.50，水解度預(yù)測(cè)值為13.80%，按最優(yōu)條件為胰蛋白酶酶解時(shí)間2.5 h、酶解溫度47.8 ℃、曲拉干酪素質(zhì)量濃度35 g/L、pH 7.5、酶添加量2 900 U/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3）得水解度為13.57%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值基本切合。

2.3 2 種蛋白酶酶解液抗氧化性

2.3.1 超氧陰離子自由基清除能力

圖 4 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig. 4 Superoxide anion radical activity of different concentrations of hydrolysates

酶解液對(duì)超氧陰離子自由基的清除屬濃度依賴型，由圖4可知，隨著酶解液質(zhì)量濃度的增大，酶解液的清除能力呈上升趨勢(shì)。其中，酶解后胰蛋白酶的清除能力顯著（P＜0.01），胰蛋白酶超氧陰離子自由基清除率從74.05%上升到82.07%，增大8.02%（P＜0.05），堿性蛋白酶組從67.31%上升到77.27%，增大9.96%（P＜0.01），曲拉干酪素溶解液（對(duì)照）增加不明顯（P＞0.05）。歧化和其他類型的反應(yīng)可產(chǎn)生H2O2和羥自由基[20-21]，使清除能力增強(qiáng)，2 種酶均能夠顯著提高水解度，產(chǎn)生的小分子質(zhì)量肽段增多[22]。鄭志強(qiáng)[10]和Raghavan[19]等報(bào)道，水解度越大，酶解液的抗氧化性越強(qiáng)，研究與Yu Jie等[23]報(bào)道的螺旋藻酶解液清除超氧陰離子自由基的趨勢(shì)相一致。

圖 5 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)羥自由基清除能力的影響Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging activity of different concentrations of hydrolysates

2.3.2 羥自由基清除能力由圖5可知，隨著酶解液質(zhì)量濃度的增大，酶解液的羥自由基清除能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但2 種蛋白酶無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。羥自由基可以與細(xì)胞中幾乎所有的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的嚴(yán)重破壞[24-25]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zhang Yufeng等[25]報(bào)道的堿性蛋白酶酶解鷹嘴豆羥自由基清除效果不一致，其原因可能是曲拉與鷹嘴豆蛋白結(jié)構(gòu)不同、酶解條件等不同所造成的。

2.3.3 DPPH自由基清除能力

圖 6 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig. 6 DPPH radical scavenging activity of different concentrations of hydrolysates

隨著酶解液質(zhì)量濃度的增大，酶解液DPPH自由基清除能力均呈上升趨勢(shì)。由圖6可見(jiàn)，5.0 mg/mL堿性蛋白酶解液DPPH自由基清除率較1.0 mg/mL提高18.32%，顯著高于胰蛋白酶（P＜0.01）。胰蛋白酶組結(jié)果增長(zhǎng)緩慢，趨勢(shì)平緩，清除能力不到30%，2 種蛋白酶之間差異顯著（P＜0.01）。堿性蛋白酶較胰蛋白酶清除效果更佳，可能是因?yàn)閴A性蛋白酶主要酶解疏水性的氨基酸，電子供體存在于酶解液中，自由基與之反應(yīng)結(jié)合為穩(wěn)定產(chǎn)物[27]。DPPH自由基可與供給質(zhì)子抗氧化劑等反應(yīng)清除自由基，降低吸光度[28]，溶液顏色從深紫色逐漸變?yōu)辄S色，通過(guò)接受電子或氫自由基形成非磁性分子[29]。結(jié)果與Ghribi等[26]報(bào)道的鷹嘴豆堿性蛋白酶酶解物DPPH自由基清除率相一致，與鄭志強(qiáng)等[10]的報(bào)道存在差異，需進(jìn)一步研究。

2.3.4 還原力

圖 7 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)還原力的影響Fig. 7 Reducing power of different concentrations of hydrolysates

由圖7可知，酶解液還原力隨著酶解液質(zhì)量濃度的增加而增大，堿性蛋白酶在1.0 mg/mL時(shí)為0.46，5.0 mg/mL達(dá)到0.64，增大26%（P＜0.01）；胰蛋白酶從1.0 mg/mL時(shí)的0.11增大到5.0 mg/mL的0.29，增大62%（P＜0.01），相比于曲拉干酪素溶解液和胰蛋白酶，堿性蛋白酶組的增加顯著（P＜0.05），但增加趨勢(shì)胰蛋白酶明顯優(yōu)于堿性蛋白酶（P＜0.01）。還原力測(cè)定通常用于評(píng)估天然抗氧化劑提供電子或氫的能力[30]，一種樣品具有更高還原能力則具有更好的供電子能力，吸光度越高，還原力越大[31]。酶解能夠提高酶解液的還原力，原因是酶解液可以作為電子供體發(fā)揮作用，釋放出來(lái)的還原劑能夠快速與鐵氰化鉀形成絡(luò)合物，使Fe3+還原成Fe2+。結(jié)果與于麗娜等[32]關(guān)于酶解花生的報(bào)道相一致。

2.3.5 Fe2+螯合能力

圖 8 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)Fe2＋螯合能力的影響Fig. 8 Fe2+ Chelating ability of different concentrations of hydrolysates

由圖8可知，酶解液對(duì)Fe2+的螯合能力隨著酶解液質(zhì)量濃度增加而增加。對(duì)于堿性蛋白酶，當(dāng)酶解液質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL時(shí)，螯合能力從20.93%增加到59.32%（P＜0.01），胰蛋白酶則從50.25%增加到78.60%（P＜0.01），本實(shí)驗(yàn)與Carrasco-Castilla等[16]報(bào)道的胰蛋白酶酶解菜豆具有良好的Fe2+螯合能力相一致。過(guò)渡金屬離子通過(guò)作為單電子供體形成烷氧基自由基而與過(guò)氧化物反應(yīng)速度非?？靃33]，在體內(nèi)發(fā)生多種氧化反應(yīng)，F(xiàn)e2+可催化Haber-Weiss反應(yīng)，即Fe2+和過(guò)氧化氫同時(shí)存在情況下，轉(zhuǎn)化為羥自由基，與鄰近的生物分子快速反應(yīng)并引起嚴(yán)重的損害[34]。胰蛋白酶屬特殊多酶體系，可水解產(chǎn)生帶有羧端的氨基酸，蛋白質(zhì)的游離羧端是金屬離子的潛在結(jié)合位點(diǎn)，酶解物作為金屬螯合化合物是有效的[35]，胰蛋白酶的螯合效果優(yōu)于堿性蛋白酶。

2.3.6 Cu2+螯合能力

圖 9 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)Cu2＋螯合能力的影響Fig. 9 Cu2+ Chelating ability of different concentrations of hydrolysates

由圖9可知，隨著酶解液質(zhì)量濃度的增加，Cu2+螯合能力逐漸增大，堿性蛋白酶組從44.52%增大到59.65%，增大15.13%（P＜0.05），胰蛋白酶組從45.67%增大到57.18%，增加11.51%（P＜0.05），與曲拉干酪素溶解液相比均顯著增大（P＜0.01），但2 種蛋白酶之間差異不顯著（P＞0.05）。由于特定的肽結(jié)構(gòu)和氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)不僅在終止自由基鏈反應(yīng)而且在螯合過(guò)渡金屬離子中起重要作用[36]。酶解后，酶解物Cu2+螯合能力增加。酶的性質(zhì)不同則酶切位點(diǎn)不同，形成的分子質(zhì)量大小不同，形成的氨基酸肽鏈組成不同，與金屬離子的配位鍵則存在差異，將導(dǎo)致酶解液金屬離子螯合能力不同[37]。此外，酶解液Cu2+螯合能力取決于Cu2+配位點(diǎn)多少、分子質(zhì)量大小以及肽段結(jié)構(gòu)等[38-39]。

3 結(jié) 論

采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)曲拉干酪素進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，分別在酶解時(shí)間3.8、2.5 h、酶解溫度49.8、47.8 ℃、曲拉干酪素質(zhì)量濃度60、35 g/L，pH 8.5、7.5，酶添加量140、2 900 U/g時(shí)水解度較高。

曲拉干酪素堿性蛋白酶和胰蛋白酶2 種酶解液，均表現(xiàn)出良好的抗氧化性和電子或氫供體能力。通過(guò)對(duì)抗氧化性的比較，清除羥自由基、DPPH自由基能力和還原力的效果堿性蛋白酶相對(duì)較好，超氧陰離子自由基清除效果則胰蛋白酶解液優(yōu)于堿性蛋白酶解液。金屬螯合能力方面，堿性蛋白酶解液Cu2+螯合能力優(yōu)于胰蛋白酶解液，而Fe2+螯合能力則相反。堿性蛋白酶酶解曲拉干酪素的水解度明顯優(yōu)于胰蛋白酶，更適宜用于曲拉干酪素的酶解。隨著對(duì)曲拉干酪素抗氧化肽活性功能研究的深入，需要對(duì)不同分子質(zhì)量肽段進(jìn)行分離、純化、鑒定，明確其肽序列，深入研究肽的結(jié)構(gòu)和特定的抗氧化機(jī)制及動(dòng)物體抗氧化性效果等。