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        基于滋味成分HPLC指紋圖譜的判別分析及相似度評價在信陽毛尖茶分等定級中的應(yīng)用

        2019-05-21 11:59:24王淑慧宋沙沙曹學(xué)麗
        食品科學(xué) 2019年8期
        關(guān)鍵詞:毛尖茶毛尖信陽

        王淑慧,宋沙沙,曹學(xué)麗*

        (北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室,北京 100048)

        中國是茶葉的發(fā)源地,栽培歷史悠久,種植幅員遼闊,種類繁多,制法工藝不斷推陳出新。信陽毛尖茶是中國的十大名茶之一,屬炒青綠茶[1]。其外形細(xì)、圓、光、直,鋒苗挺秀,色澤翠綠光潤,白毫顯露;內(nèi)質(zhì)湯色嫩綠明亮,香氣鮮濃持久,有熟板栗香,滋味鮮濃、爽口、回甘生津,葉底嫩綠明亮、勻整[2]。目前,對茶葉分等定級的方法以感官評審為主[3],該方法依賴評茶師的評茶經(jīng)驗,存在很大的主觀性,使茶葉的等級標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,市面上的茶葉品質(zhì)魚龍混雜。因此,研究茶葉品質(zhì)的科學(xué)評定方法和質(zhì)量監(jiān)測體系,對于促進(jìn)茶葉產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

        茶湯中的主要化學(xué)成分有多酚、咖啡堿、茶多糖、茶氨酸、碳水化合物和維生素等[4],對茶葉的品質(zhì)[5-6]和滋味[7-11]具有重要貢獻(xiàn)。在感官評審中,茶湯滋味對茶葉感官評審的貢獻(xiàn)率達(dá)30%~35%,占最主要位置[3]。因此,茶葉滋味的研究具有重大意義。指紋圖譜技術(shù)主要應(yīng)用于鑒別中藥的真?zhèn)魏唾|(zhì)量控制等[12-14],近年來被應(yīng)用到茶葉的質(zhì)量控制中[15-16]。本研究將指紋圖譜技術(shù)用于茶葉分等定級和質(zhì)量控制中,以信陽毛尖為研究對象,采用高效液相色譜(high performance liqulid chromatography,HPLC)技術(shù),通過建立信陽毛尖茶滋味成分HPLC指紋圖譜,對茶湯滋味成分進(jìn)行分析,將判別分析法與指紋圖譜相似度法相結(jié)合,用于確定不同等級茶樣之間的差異性,為綠茶客觀品質(zhì)評價和質(zhì)量監(jiān)控建立一種科學(xué)量化的方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料及試劑

        供試茶樣為2014年4—5月的信陽毛尖茶,均來自信陽市文新茶葉有限責(zé)任公司,包括優(yōu)質(zhì)信陽毛尖茶“道”系列4 個等級多個批次的22 個茶樣,按等級從高到低依次為觀道(5 個批次)、悟道(5 個批次)、修道(6 個批次)和品道(6 個批次);普通信陽毛尖茶“300”系列3 個等級多個批次的19 個茶樣,按等級從高到低依次為330(6 個批次)、320(7 個批次)和310(6 個批次)。用復(fù)合鋁箔袋密封樣品,保存于4 ℃冰箱中,冷藏待用。

        樣品的等級評定由具有資質(zhì)的品茶師按照GB/T 22737—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 信陽毛尖茶》[17]中對不同級別信陽毛尖茶的文字標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》[3]完成。樣品的分析工作于2014年底完成。

        乙腈(色譜級) 美國Fisher科學(xué)公司;磷酸(色譜級) 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1260 HPLC儀(配有四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、Chem Station色譜工作站等)美國Agilent公司;Atlantis T3 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱 美國Waters公司;150 mL專業(yè)茶葉審評杯 景德鎮(zhèn)陶瓷。

        1.3 方法

        1.3.1 茶湯制備

        茶湯的制備按照GB/T 23776—2009[3]沖泡綠茶的程序進(jìn)行:稱量3 g綠茶樣品于150 mL評茶杯中,倒入150 mL沸水,蓋上杯蓋沖泡5 min后,將茶湯濾出,待茶湯的溫度降低后,取一定量的茶湯過0.22 μm濾膜,進(jìn)行HPLC分析。

        1.3.2 茶湯滋味指紋圖譜建立

        分別稱取各批次信陽毛尖樣品5 份,按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行茶湯制備。根據(jù)本實驗室的前期研究[18],采用HPLC分析方法:色譜柱:Waters-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:0.04%磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫:0~60 min,4%~25% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;檢測波長:210 nm。每份信陽毛尖茶樣品均做3 針平行實驗。將所獲得的同一等級的液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版本),生成相應(yīng)等級茶葉的HPLC指紋圖譜。

        1.3.3 茶樣判別分析

        分別以2 個系列信陽毛尖為研究對象,采用判別分析法進(jìn)行等級判別。根據(jù)前期研究成果[18],篩選15 種共有特征滋味成分,如表1所示。將所得到的每個樣品色譜圖中含量最高的共有峰峰面積為參照,計算其他共有峰相對峰面積,以相對峰面積作為原始數(shù)據(jù),采用SPSS 20.0軟件,采用輸入自變量方法中的Wilks λ法進(jìn)行判別分析,建立判別方程,驗證判別方程對初識分組的分類結(jié)果[19-21]。

        表 1 信陽毛尖茶湯15 種特征滋味成分Table 1 Fifteen characteristic flavor compounds in Xinyang Maojian tea infusion

        1.3.4 指紋圖譜相似度計算

        同種綠茶的分等定級屬于小類水平上的區(qū)別,所以選擇適合同種綠茶不同等級的相似度計算方法是體現(xiàn)差異的關(guān)鍵。綜合考慮文獻(xiàn)中多種相似度計算方法后,選擇夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、新模型負(fù)指數(shù)法、改進(jìn)Nei系數(shù)法、改良程度相似度、新改良程度相似度、Manhattan距離系數(shù)法7 種計算方法進(jìn)行同種綠茶不同等級之間相似度計算。當(dāng)兩圖譜的相對差異越小時,相似度系數(shù)的取值越接近于1,距離系數(shù)越小,即茶葉等級間的差異越小。

        以優(yōu)質(zhì)信陽毛尖“道”和普通信陽毛尖“300”系列7 個等級多個批次樣品15 個特征滋味成分的HPLC平均峰面積為計算參數(shù),利用Excel軟件的數(shù)據(jù)處理功能,以最高級別觀道茶樣指紋圖譜為計算參照,將各級計算得到的各特征峰的平均峰面積分別代入7 種相似度計算方法的公式中,得到各等級與最高級別的相似度。

        1.3.4.1 夾角余弦法

        夾角余弦系數(shù)法[22]是將兩系統(tǒng)A和B的信息轉(zhuǎn)化為兩向量的相互關(guān)系,所以系統(tǒng)在質(zhì)上和量上的區(qū)別分別對應(yīng)于向量中的方向和模長。兩向量的夾角余弦見公式(1):

        式中:ai為系統(tǒng)A的第i個共有色譜峰的峰面積;bi為系統(tǒng)B的第i個共有峰的峰面積;n為系統(tǒng)中共有峰的個數(shù)。

        1.3.4.2 相關(guān)系數(shù)法

        相關(guān)系數(shù)法也稱為皮爾遜相關(guān)系數(shù)法[23],是中心化了的夾角余弦,用于測試變量之間的相關(guān)性,是形狀測度,與夾角余弦法在本質(zhì)上一樣。相關(guān)系數(shù)法計算見公式(2):

        式中:a為系統(tǒng)A的所有共有峰峰面積的平均值;b為系統(tǒng)B的所有共有峰峰面積的平均值。

        1.3.4.3 新模型負(fù)指數(shù)法

        新模型負(fù)指數(shù)方法[24]原理借鑒向量夾角法的基本思路,某物質(zhì)在兩圖譜的相對差異為A圖譜中該物質(zhì)峰面積減去B圖譜中該物質(zhì)峰面積的值與B圖譜該物質(zhì)峰面積的比值;圖譜相似度的指標(biāo)參數(shù)為圖譜整體平均相對差異的負(fù)指數(shù)。新模型負(fù)指數(shù)法計算見式(3):

        1.3.4.4 改進(jìn)Nei系數(shù)法

        改進(jìn)Nei系數(shù)法[25]是對峰重疊率法[26]的改進(jìn),原理是在保證兩色譜具有相同的色譜峰數(shù)目的前提下(無峰的對應(yīng)位置記為0),按照峰在譜圖上的保留時間進(jìn)行排序,建立峰序號與其峰面積坐標(biāo)系,將每個系統(tǒng)的色譜點描成折線,成為色譜指紋特征曲線,將相比較的兩系統(tǒng)色譜指紋圖譜相似度記為兩色譜指紋特征曲線的重合率。計算見公式(4):

        式中:n1、n2分別為兩圖譜的總峰數(shù);n為共有峰數(shù)。

        1.3.4.5 改良程度相似度法

        改良程度相似度法[27]是對程度相似度法[28]的改進(jìn)。程度相似度為各相似要素相似倍數(shù)的平均值,在實際應(yīng)用中,由于每個相似要素差異情況各不相同,因此對程度相似度的結(jié)果也會存在程度大小不同的影響。孟慶華等[25]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),并進(jìn)行實際應(yīng)用,其計算見式(5):1.3.4.6 新改良程度相似度法

        詹雪艷等[29]在改良程度相似度的基礎(chǔ)上,指出改良程度相似度不能反映差異分布不同的兩樣本的相似度,提出新的計算方法見公式(6):1.3.4.7 Manhattan距離系數(shù)法

        距離系數(shù)體現(xiàn)的是總峰面積的差異或者總峰面積的平均差異,代表絕對距離上的差異大小,距離越大,兩者的差異越大,但是不能衡量相似關(guān)系遠(yuǎn)近的程度。距離系數(shù)在色譜指紋圖譜中的應(yīng)用,通常是以共有峰為計算對象,初步衡量樣本在量上的差異[30],其計算見公式(7):

        2 結(jié)果與分析

        2.1 信陽毛尖茶HPLC指紋圖譜的建立

        圖 1 “道”系列4 個等級信陽毛尖茶HPLC指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of four grades of the “Dao” series of Xinyang Maojian tea

        圖 2 “300”系列3 個等級信陽毛尖茶HPLC指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprints of three grades of the “300” series of Xinyang Maojian tea

        從圖1、2可以看出,優(yōu)質(zhì)“道”系列在滋味物質(zhì)含量上要高于普通“300”系列,但“道”系列4 個等級間及“300”系列3 個等級間的差異并不能明顯看出。2 個系列7 個等級的信陽毛尖茶湯15 種特征滋味成分的含量見表2。

        2.2 基于滋味特征成分的信陽毛尖茶等級判別分析

        以信陽毛尖茶“道”系列4 個等級22 個樣品和“300”系列3 個等級19 個樣品的15 個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù),采用SPSS 20.0 建立典型判別函數(shù),該方法對初始等級樣本中的95.1%進(jìn)行正確分類。從圖3可知,7 個不同等級的信陽毛尖茶之間差異顯著,且普通信陽毛尖“300”系列和優(yōu)質(zhì)信陽毛尖“道”系列之間具有顯著差異,區(qū)分度也很好,實現(xiàn)對同一品種不同等級信陽毛尖茶的等級區(qū)分。表明利用茶湯滋味特征成分可以對普通和優(yōu)質(zhì)信陽毛尖進(jìn)行很好的等級判別分析,且差異顯著。

        表 2 信陽毛尖2 個系列7 個等級茶的15 個特征滋味成分含量(以峰面積計)Table 2 Peak area of 15 characteristic flavor components in seven grades of two series of Xinyang Maojian tea

        圖 3 基于HPLC指紋圖譜的信陽毛尖茶“道”系列和“300”系列判別分析Fig. 3 Discriminant classification of two series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

        分別以信陽毛尖茶“道”系列22 個樣品和“300”系列19 個樣品按相同方法分別進(jìn)行判別分析,對初始分組樣品中的100%進(jìn)行正確分類。從圖4可以看出,“道”系列4 個等級之間具有顯著差異,區(qū)分度更好。從圖5可以看出,“300”系列3 個等級之間也具有顯著差異,區(qū)分度也很好。表明采用滋味特征成分可以對優(yōu)質(zhì)信陽毛尖不同等級進(jìn)行很好的等級判別。

        圖 4 基于HPLC指紋圖譜的信陽毛尖茶“道”系列4 個等級判別分析Fig. 4 Discriminant classification of four grades of the “Dao” series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

        圖 5 基于HPLC指紋圖譜的信陽毛尖茶“300”系列3 個等級判別分析Fig. 5 The discriminant classification of three grades of the “300”series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

        2.3 不同等級信陽毛尖茶的HPLC指紋圖譜相似度評價

        以最高級別觀道茶樣指紋圖譜為參照,計算得到的7 種相似度計算結(jié)果如表3所示。除距離系數(shù)法外,6 種相似度計算法對信陽毛尖茶不同等級茶葉的區(qū)分度從夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、改進(jìn)Nei系數(shù)法、新模型負(fù)指數(shù)、改良程度相似度法、新改良程度相似度法依次提高,新改良程度相似度法能最大程度地反映出不同等級信陽毛尖之間的差距,且普通“300”與優(yōu)質(zhì)“道”系列間相似度較低,差異較大,可見“300”系列茶葉級別較低。采用該方法對茶葉進(jìn)行分等定級與市面等級相一致,且能計算出各等級間的差異大小,表明采用指紋圖譜相似度計算的方法能對茶葉進(jìn)行分等定級。

        表 3 信陽毛尖茶“道”和“300”系列HPLC指紋圖譜相似度計算Table 3 Similarity calculation of HPLC fingerprints for the “Dao” and“300” series of Xinyang Maojian tea

        若僅對“道”系列4 個等級的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,仍是新改良程度相似度法最能反映等級之間的差異程度。觀道與悟、修、品道間差異顯著,悟道與修道接近,它們與品道間的差異較小,但與實際的等級相一致。表明采用指紋圖譜相似度的方法能對優(yōu)質(zhì)信陽毛尖茶進(jìn)行分等定級。

        若對“300”系列3 個等級的數(shù)據(jù)進(jìn)行單獨處理,以最高級別330指紋圖譜為計算參照,按上述相同的方法計算相似度,結(jié)果如表4所示,也是新改良程度相似度法最能反映等級之間的差異程度,3 個等級茶葉間的差異較小,但也能明顯區(qū)分,且與實際等級相一致。表明采用指紋圖譜相似度的方法能對普通信陽毛尖茶也能進(jìn)行分等定級。

        表 4 信陽毛尖茶“300”系列HPLC指紋圖譜相似度Table 4 Similarity calculation of HPLC fingerprints for the “300”series of Xinyang Maojian tea

        3 結(jié) 論

        采用HPLC方法分別建立信陽毛尖“道”系列和“300”系列共7 個等級茶葉滋味成分HPLC指紋圖譜,但同品種不同等級茶葉間的差異很難從其指紋圖譜中直接看出。因而本實驗首先基于15 種滋味特征成分,采用判別分析法對2 個系列7 個等級41 個樣品進(jìn)行判別分析,其等級區(qū)分正確率為95.1%,分別對2 個系列的茶樣進(jìn)行判別分析,正確率則近100%,表明該方法能夠?qū)ν贩N茶葉進(jìn)行很好的等級區(qū)分判別。采用7 種指紋圖譜相似度計算方法對各等級茶葉間的相似度進(jìn)行計算,結(jié)果顯示,各相似度計算方法均能在一定程度上反映茶葉等級間的差異大小,其中以新改良程度相似度法最佳,采用該方法對茶葉分等定級結(jié)果與其實際等級相一致,且可以實現(xiàn)對各等級間的差異量化,表明可以將所建立的指紋圖譜相似度計算方法應(yīng)用于同品種不同等級綠茶的分等定級中。

        對未知樣品的分級要通過先建立其HPLC指紋圖譜,采用上述方法,尤其是新改良程度相似度計算方法,與信陽毛尖茶標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度對比,確定未知茶樣的等級。該結(jié)果可為茶葉分等定級提供理論研究支持和方向。

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