許 引，呂小健，李 明*，龍 濤，徐蘭英，李士明,*

（1.武漢紡織大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430200；2.黃岡師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000）

柑橘屬植物的果皮具有很高的藥用價值。例如，陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘（Citrus reticulata Blanco）的干燥成熟果皮，可藥食兩用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，陳皮性溫味苦辛，可歸為脾肺兩經(jīng)，具有疏肝理氣功效。陳皮及其他柑橘皮的特征成分為黃酮類化合物：多羥基黃酮化合物[1-2]、多甲氧基黃酮以及羥基多甲氧基黃酮[3-7]，例如川陳皮素可以抑制NF-κB，降低Cox-2和iNOS等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[8-9]；可抑制清道夫受體表達(dá)，抑制血脂對靶細(xì)胞的攻擊[10-11]；橘皮黃酮可以有效抑制血小板聚集，防止心血管栓塞發(fā)生等[12]；川陳皮素和陳皮素能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子的分泌和脂肪細(xì)胞的增大[13]；橘皮黃酮可直接對抗肥胖，降低實(shí)驗(yàn)動物甘油三酯和膽固醇的水平[14]。

近期研究表明，橘皮中橘皮素、川陳皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮等多甲氧基黃酮，以及5-去甲基川陳皮素等羥基多甲氧基黃酮是柑橘屬植物果實(shí)皮的特有成分[3]。研究發(fā)現(xiàn)，陳皮的藥效及重要生物活性大多與其含有的黃酮，特別是與多甲氧基黃酮相關(guān)[15-16]。同樣，柑橘果皮中多甲氧基黃酮的種類和含量受柑橘種類和多種生長環(huán)境因素的影響。柑橘果皮來源選材不同，其中多甲氧基黃酮種類和含量也會不同，進(jìn)而影響橘皮的藥效[17]。因此，分析不同品種、不同產(chǎn)地柑橘果皮中多甲氧基黃酮含量，對于橘皮的選材及多甲氧基黃酮的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，國內(nèi)外對柑橘果皮尤其是陳皮的研究逐漸增多，但研究多集中于其中一個或幾個常見品種[18]，鮮少有對不同品種的柑橘果皮、陳皮中的多甲氧基黃酮成分進(jìn)行綜合考察分析。文獻(xiàn)多報道橘皮總黃酮含量的測定，方法主要有分光光度法[19-20]、二氯氧鋯比色法[21]、薄層色譜法[22-23]，以及運(yùn)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定橘皮中常見的多甲氧基黃酮，如川陳皮素、橘皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮含量的測定方法也有報道[24-27]，但是3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、5,6,7,4’-四甲氧基黃酮和5-去甲基橘皮素相關(guān)定量分析的報道很少。本實(shí)驗(yàn)建立同時測定橘皮中9 種多甲氧基黃酮（結(jié)構(gòu)式見圖1）含量的方法，以期為多甲氧基黃酮柑橘皮原材料選材、質(zhì)量合理控制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

9 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，包括5,6,7,4’-四甲氧基黃酮、甜橙黃酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲氧基川陳皮素、5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮，為實(shí)驗(yàn)室自制，純度均大于98.5%。

1.1.2 柑橘皮及陳皮

新鮮柑橘共11 種，包括2 種橙類（安遠(yuǎn)臍橙、贛南臍橙）；3 種柑類（重慶柑橘、蒲江丑橘、廣西皇帝柑）；5 種橘類（蒲江美人橘、廣西沙糖橘、臺州蜜橘、宜昌蜜橘、黃岡本地橘）；金錢橘，購買于京東生鮮水果超市，由黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院鑒定確認(rèn)。新會陳皮、江西陳皮、浙江陳皮購于湖北黃州大藥房。

圖 1 9 種多甲氧基黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of nine polymethoxyflavonoids (PMFs)

1.1.3 試劑

無水乙醇（分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純）上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 II HPLC儀 美國安捷倫公司；GWX-9623MB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6020真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-III循環(huán)水真空泵、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BSA124S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DS-5510DT型超聲波清洗器 上海生析超聲儀器有限公司；UPT-II-10T優(yōu)普系列超純水器成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC條件

HPLC色譜柱：Phenomenex Luna C18（2）液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相為水（A）和乙腈（B）。流動相洗脫梯度為：0～15 min，40%～55% B；15～20 min，55%～70% B；20～25 min，70%～80% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：326 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別精確稱取一定質(zhì)量的甜橙黃酮、5,6,7,4’-四甲氧基黃酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲基川陳皮素和5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮9 種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成一定質(zhì)量濃度范圍為1.187～840 μg/mL對照品溶液。將對照品溶液用0.22 μm微孔濾膜濾過，用HPLC分析檢測，并建立相對應(yīng)的回歸方程。

1.3.3 柑橘類果皮中多甲氧基黃酮的提取

1.3.3.1 超聲提取多甲氧基黃酮

以廣西砂糖橘、新會陳皮及廣西皇帝柑為例，分別采用回流提取、超聲提取、索氏提取、微波提取、超臨界提取等提取方法，對不同提取時間、溫度、超聲功率、料液比、提取溶劑等因素做單因素試驗(yàn)探究總目標(biāo)多甲氧基黃酮提取率，以提取率為主要指標(biāo)，綜合考慮提取方法，選擇以無水乙醇作溶劑、料液比1∶10（g/mL）、超聲提取柑橘果皮中多甲氧基黃酮化合物，超聲時間40 min，超聲功率450 W，超聲頻率40 kHz。

1.3.3.2 樣品的制備

將各果實(shí)樣品洗凈，收集的果皮于60 ℃干燥2～3 周，然后將干燥果皮粉碎備用；新會陳皮、浙江陳皮、江西陳皮直接粉碎成粉末備用。稱取干燥柑橘果皮粉末各4.0 g，用40 mL無水乙醇按1.3.3.1節(jié)超聲提取40 min，放冷，過濾，濾液置50 mL容量瓶中，用少量乙醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ糠N柑橘果皮提取實(shí)驗(yàn)平行3 組。

1.3.4 柑橘類果皮中多甲氧基黃酮的檢測

將供試品溶液過0.22 μm濾膜后直接注入進(jìn)樣瓶進(jìn)行HPLC分析，以標(biāo)品溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸計算得9 種多甲氧基黃酮回歸方程，檢測5,6,7,4’-四甲氧基黃酮、甜橙黃酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲基川陳皮素和5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮的含量。每種黃酮分別以信噪比為3和10對應(yīng)的多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度計算檢出限和定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測結(jié)果

圖 2 9 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC圖Fig. 2 HPLC separation of a mixture of nine PMFs standards

由圖2可知，5-去甲基橘皮素在C18反相柱的保留時間比其相對應(yīng)的多甲氧基黃酮更長，其原因可解釋為由于5-位的羥基氫與4-位的羰基氧形成一個六圓環(huán)平面穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，而使得它們的極性減弱，在反相柱中表現(xiàn)出更強(qiáng)的親脂性，因此保留時間較長。由圖2可見，9 種多甲氧基黃酮均具有較好的峰形和分離度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

由表1可知，9 種多甲氧基黃酮在對照品溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r2不小于0.999 8。用已知質(zhì)量濃度的純品檢測9 種工作曲線準(zhǔn)確度，實(shí)際測得質(zhì)量濃度與已知檢測質(zhì)量濃度都在±5%以內(nèi)，說明在檢測區(qū)間范圍內(nèi)有很好的檢測準(zhǔn)確度。日內(nèi)檢測和日間檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明在檢測范圍內(nèi)（≤5%），這9 種多甲氧基黃酮工作區(qū)間線性關(guān)系很好，有很高的精確度。

表 1 9 種多甲氧基黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 1 Calibration equations, linear range and limits of detection and quantification for nine PMFs

2.3 柑橘果皮中9 種多甲氧基黃酮含量檢測結(jié)果

圖 3 廣西皇帝柑果皮提取物HPLC圖Fig. 3 HPLC profile of Emperor tangerine peel extract

由圖3可知，廣西皇帝柑果皮中川陳皮素和橘皮素含量均較高，但未檢出3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮和5,6,7,4’-四甲氧基黃酮。該方法較紫外分光光度計法、薄層色譜法更加準(zhǔn)確，簡便、快速。

從表2可知，不同品種及同一品種不同產(chǎn)地的柑橘果皮中的多甲氧基黃酮含量和種類有明顯差異。在這14 種柑橘果皮樣品中，金錢橘果皮中未檢測到多甲氧基黃酮，柑橘果皮樣品中多甲氧基黃酮總含量為998.95～10 412.18 μg/g，重慶柑橘、廣西皇帝柑、廣西沙糖橘和江西陳皮中多甲氧基黃酮總含量均較高，達(dá)到7 495.19 μg/g以上，其中廣西沙糖橘多甲基黃酮總含量高達(dá)10 412.18 μg/g。果皮中多甲基黃酮總含量最少的品種是臺州蜜橘（998.85 μg/g）。因此，建議除橙皮苷外，應(yīng)該增加多甲氧基黃酮類成分作為陳皮的質(zhì)控指標(biāo)。

由表2可知，川陳皮素與橘皮素幾乎是所有柑橘果皮中最常見且含量最高的多甲氧基黃酮，尤其體現(xiàn)在重慶柑橘、廣西皇帝柑、廣西沙糖橘、江西陳皮、蒲江美人橘和新會陳皮。近年來，隨著其生物活性研究的愈加深入，對川陳皮素和橘皮素單品的需求量越來越大，因此選取最佳柑橘果皮品種及產(chǎn)地來源顯得尤為重要。在本研究中，重慶柑橘、蒲江美人橘、廣西沙糖橘、廣西皇帝柑、新會陳皮、江西陳皮中川陳皮素含量相對較高（2 239.65～5 324.90 μg/g），其中廣西沙糖橘果皮中川陳皮素含量最高達(dá)到5 324.90 μg/g；重慶柑橘、廣西沙糖橘、廣西皇帝柑、新會陳皮、江西陳皮中橘皮素含量較高（1 685.98～4 005.66 μg/g），其中廣西沙糖橘果皮中橘皮素含量達(dá)到4 005.66 μg/g。所以，廣西砂糖橘果皮可作為川陳皮素和橘皮素的最佳天然原材料，建議考慮將砂糖橘作為陳皮藥材選材來源。而安遠(yuǎn)臍橙和贛南臍橙果皮中多甲氧基黃酮含量很低，據(jù)報道，臍橙中橙皮苷含量也較低[25,28]，所以臍橙不適合作為陳皮的制作原料。

去甲基多甲氧基黃酮是柑橘果皮中另外一種重要的黃酮化合物，以前研究表明，去甲基多甲氧基黃酮比多甲氧基黃酮有更強(qiáng)的抗腫瘤和抗炎活性[29-30]。在此研究中，重慶柑橘、浦江美人橘、江西陳皮和廣西皇帝柑中5-去甲基川陳皮素總含量較高（384.99～637.61 μg/g），但仍然比其他非去甲基多甲氧基黃酮含量低很多。另外，5-去甲基橘皮素在所檢測的所有品種柑橘果皮中含量均極低，大部分品種的柑橘果皮中都未檢出5-去甲基橘皮素。因此，在天然柑橘果皮中去甲基多甲氧基黃酮含量偏低，新鮮柑橘皮經(jīng)過長時間，例如3 a以上避光存放，由于微生物的作用，很可能產(chǎn)生更多比例或者不同種類的去甲基多甲氧基黃酮，加上揮發(fā)油的大量消失及糖苷健在酸性和微生物環(huán)境下斷裂，使苷元、去甲基多甲氧基黃酮的含量成倍增長，因此大大增強(qiáng)陳皮的活性。而且，模仿陳皮陳化的研究工作已經(jīng)開始并取得初步成效[31-32]，目的是快速、高效地研究橘皮多甲氧基黃酮有益健康的機(jī)理，并為開發(fā)功能食品提供數(shù)據(jù)支撐。

表 2 不同品種柑橘果皮中9 種多甲氧基黃酮總含量Table 2 Contents of six PMFs and three OHPMFs in different varieties of citrus peels μg/g

3 結(jié) 論

本研究以乙醇為溶劑，從14 種不同品種橘柑果皮中超聲提取黃酮混合物，建立高效、高穩(wěn)定性、并能夠同時檢測9 種主要多甲氧基黃酮HPLC分析方法，該方法較紫外-分光光度法等常見分析方法更準(zhǔn)確、簡便、快速，不需昂貴的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器，即可準(zhǔn)確快速檢測9 種或以上的多甲氧基黃酮。另外，此研究結(jié)果表明，柑橘果皮例如陳皮，作為藥食兩用選材等功能食品和藥材，多甲氧基黃酮含量及其種類應(yīng)該列為陳皮的質(zhì)控指標(biāo)，與生物活性建立定性定量的構(gòu)效關(guān)系。