張慶橋,王一鵬,魏艷秋,米建華,趙 雪,孫立旦,宋勤葉

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院,河北 邯鄲 056021；2.河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院 河北省獸用生物制品工程技術研究中心,河北 保定 071000；3.河北省淶水縣畜牧水產局,河北 淶水 074199)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)成員。該病毒引起的豬流行性腹瀉(PED)是豬場常見的一種腸道傳染病,以豬嘔吐、腹瀉、脫水和死亡為特征。1971年PED首次發(fā)生于英國的生長育肥豬群,1973年我國上海發(fā)生PED,隨后該病主要以地方流行性形式在國內多地豬場發(fā)生[1]。但2010年秋冬以來,PEDV變異株引起的PED在國內暴發(fā)流行,初生仔豬的發(fā)病率和死亡率高達100%,給養(yǎng)豬場造成了巨大經濟損失[2-4]。目前PEDV是導致仔豬腹瀉的最重要的致病因子[5-6],此外,豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒豬δ-冠狀病毒以及大腸桿菌等也是引起仔豬腹瀉常見病原[5-6]。不同病原引起的臨床表現相似,給臨床診斷造成了很大困難。因此,研究高效特異的診斷試劑,建立快速檢測技術,具有重要實踐意義。

單克隆抗體(McAb)以其高特異性、高均一性、方便生產、容易標準化和商品化等優(yōu)勢,成為病原學或血清學檢測技術、感染與免疫機制研究以及靶向治療的理想工具。核衣殼蛋白是PEDV的主要結構蛋白,保守性高,在PEDV感染早期,細胞內N蛋白濃度高,是病毒感染早期診斷與監(jiān)測的主要靶蛋白[7]。此外,N蛋白還與病毒致病以及機體的細胞免疫應答反應有關[8]。本研究旨在用體外表達的重組N蛋白作為免疫原,應用雜交瘤技術,獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株,制備PEDV特異性單克隆抗體,為PEDV診斷或檢測技術的進一步研發(fā)以及感染免疫機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株 Vero細胞和SP2/0骨髓瘤細胞,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表達PEDV N蛋白的工程菌E.Coli BL21,由河北農業(yè)大學傳染病實驗室制備。PEDV HBMC2012株(GenBank ID：JX163294),由河北農業(yè)大學傳染病實驗室分離鑒定與保存。

1.2 主要試劑與試劑盒 DMEM、HAT(次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷)和HT(次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷),均購自Sigma公司；胎牛血清,購自Hyclone公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(H+L),購自康為世紀生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgM,購自武漢博士徳生物工程有限公司；山羊抗鼠 IgG+IgM H&L(FITC),Abcam公司產品。Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit,購自Thermo公司；IgM類單克隆抗體純化試劑盒,購自北京博奧龍免疫技術有限公司。

1.3 實驗動物 BALB/c小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.4 間接 ELISA 每孔用0.1 μg純化的PEDV包被96孔酶標板；棄去包被液,洗滌3次；每孔加入100 μL封閉液,37℃封閉1 h；棄去封閉液,每孔加入100 μL鼠抗 PEDV陽性血清(1∶40倍稀釋),37℃孵育1 h,洗滌；加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶2 000倍稀釋),100 μL/孔,37 ℃孵育45 min,洗滌；加入 TMB底物溶液,100 μL/孔,避光反應15 min；加入2 mol/L 的 H2SO4,50 μL/孔,終止反應。用自動酶聯檢測儀測定OD450nm值,當待檢樣本的OD450nm值≥0.3時,判定為抗體陽性；當OD450nm值＜0.3時判定為陰性。

1.5 PEDV-N重組蛋白的制備 參照文獻[9]所述方法,將表達PEDV-N蛋白的E.Coli BL21單個菌落接種到Amp+/LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng),待對數生長期(OD600nm值=0.6～0.8),用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達5 h。離心收集菌體,冰浴下超聲裂解細胞；離心,收集上清。按照Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒說明書,純化重組N蛋白,回收透析后的蛋白,測定蛋白含量,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動物免疫 用純化的PEDV-N重組蛋白免疫4只6～8周齡的BALB/c小鼠,連續(xù)免疫3次,間隔兩周,每次每只小鼠經背部皮下注射50 μg蛋白。首次免疫抗原與弗氏完全佐劑乳化,第2、3次免疫抗原與弗氏不完全佐劑乳化。最后1次免疫后10 d,用間接ELISA檢測小鼠血清中的PEDV特異性抗體水平。在融合前3 d每只小鼠腹腔注射100 μg蛋白,進行加強免疫。

1.7 雜交瘤細胞株的建立

1.7.1 細胞融合 無菌摘出加強免疫后3 d的小鼠脾臟,制備脾細胞。將脾細胞與SP/20骨髓瘤細胞按照5∶1的比例混合,1 000 r/min離心10 min,棄上清；取細胞沉淀,使其均勻松散成糊狀；應用聚乙二醇(PEG 4 000)方法使脾細胞和雜交瘤細胞融合。然后將融合后的細胞加入到鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中,100 μL/孔,置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后的第3天、6天、9天用HAT的1640培養(yǎng)液半量換液,第12天改用含1%HT的DMEM培養(yǎng)液半量換液,第14天后用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液半量換液。

1.7.2 陽性雜交瘤細胞的篩選與克隆 當孔內雜交瘤細胞克隆生長到孔底面積的1/4～1/3時,用1.4的間接ELISA方法篩檢分泌特異抗體的陽性孔。采用有限稀釋法對陽性孔細胞進行3～4次亞克隆,當克隆細胞株的所有細胞孔的上清液結果均為陽性時,擴大培養(yǎng)陽性雜交瘤細胞,并凍存于液氮中。

1.7.3 雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性檢測 復蘇凍存的陽性雜交瘤細胞,進行傳代培養(yǎng)。收集第2、5、10、15、20、25、30 代的細胞培養(yǎng)上清,用間接ELISA法檢測細胞分泌的抗體水平,評價雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.8 單克隆抗體的大量制備 采用體內誘生腹水法大量制備單克隆抗體。取雌性BALB/c小鼠(≥12周齡),每只小鼠腹腔注射滅菌的石蠟油10～14 d后,腹腔注射雜交瘤細胞5×106個/只。約7～10 d后,抽取腹水,8 000 r/min離心10 min,收集上清,按照IgM類單克隆抗體純化試劑盒的說明書純化腹水,ELISA測定抗體效價后,分裝后凍存于-80℃。

1.9 單克隆抗體的鑒定

1.9.1 單克隆抗體的類和亞類的鑒定將獲取的單克隆抗體作1∶50倍稀釋,按照鼠單克隆抗體類/亞類鑒定ELISA試劑盒(Thermo Scientific)的說明書進行抗體類型鑒定,當OD450nm值≥0.2判為陽性反應。

1.9.2 Western Blot試驗 用PEDV N蛋白進行SDS-PAGE電泳,通過半干轉印法將N蛋白轉印到PVDF膜上,封閉后,取1∶400倍稀釋的腹水作Western Blot,檢測抗體與N蛋白的特異性結合活性。

1.9.3 間接免疫熒光試驗(IFA) 將生長良好的Vero細胞鋪于96孔板,待細胞單層生長達90%匯合時,感染HBQY2016株(0.5 MOI),同時設立未接毒陰性對照；將培養(yǎng)板至于37℃ 5%CO2孵育1 h；棄去病毒液,加入MEM維持液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。按照文獻[10]所述方法,將制備的腹水作1∶1 000倍稀釋,進行間接免疫熒光試驗,分析抗體與PEDV的結合特性。

1.10 單克隆抗體的初步應用

1.10.1 免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)用HBQY2016株感染(0.1 MOI)生長良好的Vero細胞,同時設立非感染陰性對照。感染后48 h,棄去孔內液體,PBS輕洗細胞。每孔加入200 μL固定液(40%丙酮和0.2%BSA的PBS),室溫固定20 min；棄去固定液,PBS洗滌3次；每孔加入100 μL 30%H2O2和甲醇混合液(1∶50),室溫孵育 20 min；棄去孔中液體,PBST洗滌細胞3次；用含2%BSA的PBST于37℃封閉30 min；棄去封閉液,每孔加入100 μL單克隆抗體(4A7,1∶1 000倍稀釋),37℃溫育1 h；PBST洗滌5次,加入50 μL山羊抗鼠IgMHRP(1∶2 000倍稀釋),37℃溫育45 min；PBST洗滌5次,每孔加入100 μL DAB溶液,室溫顯色10～15 min,用水沖洗終止反應,顯微鏡下觀察結果。

1.10.2 免疫組化 取QY2016株人工感染初生仔豬的小腸,4%多聚甲醛固定后,制成石蠟切片,經過脫蠟水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶活性以及封閉后,取1∶500稀釋的腹水(4A7),通過免疫組化技術,檢測感染豬小腸內的病毒。

2 結果

2.1 免疫鼠血清特異性抗體 第3次免疫后10 d,4只小鼠的血清抗體全部轉陽,ELISA抗體效價在1∶1 280～1∶2 560 之間(圖 1)。 選擇抗體效價為1∶2 560的小鼠用于細胞融合前進行沖擊免疫。

2.2 雜交瘤細胞株 免疫小鼠的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合后,以純化的PEDV作為包被抗原用間接ELISA方法篩選陽性克隆孔,然后通過有限稀釋法對陽性克隆孔進行3～5次亞克隆,最終獲得了4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞,分別命名為：4A7、6C1、5E10和6F7,其分泌的抗體效價分別為：1∶3 200、1∶1 600、1∶800、1∶800(圖 2a)。 復蘇凍存的4株雜交瘤細胞,并連續(xù)傳代培養(yǎng)30代,4A7和6C1的抗體效價穩(wěn)定在1∶1 600～1∶3 200之間,5E10與6F7的抗體效價在1∶800～1∶1 600之間,表明4株雜交瘤細胞具有良好的抗體分泌穩(wěn)定性。4A7、6C1、5E10和6F7雜交瘤細胞誘生的腹水抗體效價分別為：1∶106、1∶105、1∶105和 1∶105(圖 2b)。

2.3 單克隆抗體的類、亞類與型 經鼠單克隆抗體類/亞類鑒定ELISA試劑盒鑒定,4A7、6C1、5E10和6F7四株雜交瘤細胞分泌的抗體均與抗IgM抗體、抗κ輕鏈抗體反應,OD450nm值＞0.2,表明獲得的4株雜交瘤細胞分泌的抗體均為IgM,其輕鏈均為κ鏈(表1略)。

2.4 單克隆抗體能與PEDV-N蛋白特異性結合Western Blot結果顯示,4株單抗與PEDV N蛋白反應后,均在40 kDa處出現清晰條帶(圖3),說明4株單克隆抗體均能夠與PEDV N蛋白發(fā)生特異結合。

圖2 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液和小鼠腹水中的PEDV特異性抗體效價

圖3 單克隆抗體與PEDV-N蛋白反應的Western-Blot鑒定

2.5 單克隆抗體能與PEDV特異性結合 IFA檢測顯示,4株單抗均能與PEDV感染Vero細胞內的病毒發(fā)生特異性結合,在胞漿內發(fā)出特異性綠色熒光,而未感染病毒的陰性對照細胞內沒有綠色熒光(見封三彩版圖4)。該結果表明,制備的4株單抗均能夠與PEDV發(fā)生良好的特異性免疫反應。

圖4 單克隆抗體與PEDV反應的間接免疫熒光試驗

2.6 單克隆抗體的初步應用

2.6.1 用于體外感染的PEDV鑒定 通過IPMA,用獲取的單抗4A7檢測PEDV感染Vero細胞內的病毒抗原,結果在感染細胞胞漿內出現棕色信號,而在陰性對照細胞內沒有出現棕色信號(見封三彩版圖5)。該結果表明,制備的單抗能夠特異地檢測到感染細胞內的特異性病毒抗原,可通過IPMA試驗用于PEDV鑒定及細胞感染情況分析。

圖5 用單抗4A7通過IPMA鑒定Vero細胞內的PEDV (×200)

2.6.2 用于體內感染的PEDV檢測與定位 通過免疫組化技術,用制備的單抗4A7檢測PEDV感染豬的小腸內的病毒抗原,結果在小腸上皮細胞內出現明顯的棕色信號(見封三彩版圖6),表明4A7能夠與感染豬小腸內的PEDV抗原發(fā)生特異性結合,單抗可用于感染組織內PEDV檢測與定位分析。

圖6 用單抗4A7通過免疫組化試驗檢測PEDV感染豬小腸中的病毒 (×100)

3 討論

豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、δ-冠狀病毒及輪狀病毒是引起仔豬腹瀉的常見病毒,臨床上這些病毒可單獨或混合感染引起腹瀉,臨床癥狀類似,需要實驗室診斷才能夠確診[5-6,11]。對采集的仔豬腹瀉樣本的流行病學調查顯示,近年來PEDV的檢出率最高,是導致初生仔豬腹瀉、死亡的最主要原因[5,6]。研制快速、準確診斷PED的檢測試劑,對有效防治該病、降低經濟損失具有重要意義。

由于病毒的體外培養(yǎng)、提取和純化困難,花費時間長、成本高,所以通過分子生物學技術,在體外表達重組蛋白,以該重組蛋白作為抗原在單克隆抗體和其他檢測技術的研究中應用十分廣泛。本研究首次表達、提取和純化了PEDV重組N蛋白,以其作為免疫原免疫小鼠,制備免疫脾細胞。此方案顯著降低了抗原制備成本,縮短了單克隆抗體的制備周期?？紤]到抗體的抗原結合活性與特異性,本試驗在篩選陽性雜交瘤細胞時,用PEDV作為包被抗原,以確保篩選到的克隆為分泌PEDV特異單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞。

病毒、細菌、大分子蛋白等抗原可誘導機體產生免疫反應,引起B(yǎng)細胞活化。活化的B細胞分化為不同漿細胞克隆,產生與抗原有特異性結合能力的不同類別的抗體,如IgG、IgM、IgA和gE等。當抗原初次免疫小鼠后,體內特異性抗體含量較低,主要成分為IgM；二次免疫后,抗體含量升高,此時抗體的主要成分為IgG,同時還會有少量的IgM?？贵w類別發(fā)生轉換受到多種因素的影響,如抗原性質、免疫途徑與免疫佐劑、激活的Th細胞以及細胞因子等[12]。本試驗中,用重組N蛋白共免疫了小鼠3次,在細胞融合前3 d,給小鼠進行了沖擊免疫,此時體內漿細胞分泌的抗體應該以IgG類為主,但是本試驗篩選出來的4株單克隆抗體均為IgMκ。此抗體類別與王隆柏等(2017)[13]報道的結果一致,其制備了兩株單克隆抗體,其中識別PEDV N蛋白的為IgM,識別M蛋白的為IgG2a。該結果提示,N蛋白可能更容易誘導IgM的產生,此現象很可能與蛋白本身的抗原性質有關。至于這4株單抗識別的抗原表位是否相同以及表位序列,有待進一步鑒定。

ELISA、Western Blot和免疫熒光鑒定結果表明,制備的4株單抗能夠與PEDV-N蛋白和細胞內病毒發(fā)生特異性結合,說明4株抗體具有良好的抗原結合活性。進一步通過免疫組化技術和IPMA證明,單克隆抗體(4A7)能夠特異地識別PEDV人工感染豬小腸組織和感染Vero細胞內的病毒。這些試驗結果說明,本試驗制備的單抗能夠用于PEDV抗原檢測及感染病毒的組織定位分析,并可為ELISA、免疫層析試紙條以及化學發(fā)光免疫分析等PEDV診斷或檢測技術的研發(fā)奠定基礎。