郎志芳 劉蘭濤 王洪偉 李姝

DN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一， 在我國， DN已成為血液透析的重要病因和糖尿病患者的主要死因［1］。目前，對DN還沒有很好的治療措施， 因此研究DN發(fā)病機制， 尋找有效的治療手段對防治DN具有重大意義［2］。本次研究的目的在于觀察并探討絞股藍對DN免疫功能的影響， 以40只大鼠作為研究樣本展開研究， 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本次研究共選取均為正常飼養(yǎng)環(huán)境下實驗用大鼠40只， 隨機分為正常參考組、DN比對組、絞股藍高劑量組、絞股藍中劑量組、絞股藍低劑量組， 每組8只。

1.2 入選標準 ①大鼠質(zhì)量在200～280 g。②實驗用DN大鼠具備相應特征， 符合大鼠糖尿病腎病診斷標準。

1.3 研究方法 正常參考組均為正常大鼠。除正常參考組外， 其他組大鼠均腹腔注射STZ， 制備DN模型， 然后給予絞股藍治療， 其中， 絞股藍低劑量組的絞股藍藥量為5 g/kg， 絞股藍中劑量組為10 g/kg， 絞股藍高劑量組為20 g/kg。

1.4 觀察指標 10周后觀察并對比各組大鼠TNF、IL-1、IL-6、 CD4+、CD8+和Th1、Th2以及免疫器官指數(shù)。其中TNF、IL-1、IL-6以酶聯(lián)免疫吸附法測定， Th1、Th2經(jīng)流式細胞儀測定。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示， 采用t檢驗， 多組比較采用方差分析；計數(shù)資料以率(%)表示， 采用χ2檢驗。P＜0.05指標表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

①TNF、IL-1、IL-6水平：五組大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=108.91、22.23、5.71，P＜0.05)， 且正常參考組＜絞股藍高劑量組＜絞股藍中劑量組＜絞股藍低劑量組＜DN比對組；提示絞股藍可有效降低DN大鼠的TNF、IL-1、IL-6水平， 且有明顯的劑量依賴性。見表1。②CD4+、CD8+、Th1水平：五組大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=71.72、13.89、22.34，P＜0.05)；CD4+水平：正常參考組＜絞股藍高劑量組＜絞股藍中劑量組＜絞股藍低劑量組＜DN比對組；CD8+和Th1水平：正常參考組＞絞股藍高劑量組＞絞股藍中劑量組＞絞股藍低劑量組＞DN比對組；提示絞股藍在CD4+、CD8+、Th1指標表達中具有劑量依賴性。見表2。③Th2、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)水平：各組大鼠Th2、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=23.69、36.85、64.84，P＜0.05)；提示應用絞股藍后DN大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均增加， 且具有明顯的劑量依賴性。見表3。

表1 各組大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比較( ±s, pg/ml)

表1 各組大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比較( ±s, pg/ml)

注：五組比較, P＜0.05

組別 只數(shù) TNF IL-1 IL-6正常參考組 8 50.34±6.12 18.10±2.93 11.36±2.01 DN 比對組 8 59.46±5.17 25.39±3.71 18.32±3.48絞股藍高劑量組 8 53.17±5.78 19.64±2.62 13.29±2.75絞股藍中劑量組 8 56.79±4.98 22.61±2.88 15.49±2.43絞股藍低劑量組 8 57.14±4.92 23.05±3.02 15.67±3.04 F 108.91 22.23 5.71 P 0.00 0.00 0.00

表2 各組大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比較( ±s)

表2 各組大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比較( ±s)

注：五組比較, P＜0.05

組別 只數(shù) CD4+(%) CD8+(%) Th1(‰)正常參考組 8 35.48±4.05 23.87±3.08 32.87±4.11 DN 比對組 8 45.39±4.76 17.89±2.78 21.78±3.20絞股藍高劑量組 8 37.69±4.23 22.51±3.12 29.69±4.73絞股藍中劑量組 8 42.03±4.87 20.30±2.96 24.83±3.55絞股藍低劑量組 8 42.34±4.62 20.11±2.90 24.22±3.47 F 71.72 13.89 22.34 P 0.00 0.00 0.00

表3 各組大鼠Th2、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)水平比較( ±s)

表3 各組大鼠Th2、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)水平比較( ±s)

注：五組比較, P＜0.05

組別 只數(shù) Th2(‰) 胸腺指數(shù)(mg/10 g) 脾臟指數(shù)(mg/10 g)正常參考組 8 20.57±5.21 38.24±4.28 46.51±4.53 DN 比對組 8 33.25±4.88 28.95±4.19 34.87±3.99絞股藍高劑量組 8 22.17±4.73 36.03±5.01 43.18±4.34絞股藍中劑量組 8 29.45±4.67 32.51±4.03 37.25±4.03絞股藍低劑量組 8 29.68±4.79 31.88±4.16 37.12±4.10 F 23.69 36.85 64.84 P 0.00 0.00 0.00

3 討論

3.1 研究背景 DN的發(fā)病機制及其進行性腎損害的機制至今尚未完全明了。而腎小球硬化是多種原因?qū)е履I小球損傷和病變的共同結(jié)局， 也是腎功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)。而炎癥和免疫功能異?？蓪е?、加重腎臟損傷， 導致DN的發(fā)生［3，4］。

絞股藍含有絞股藍皂苷、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、黃酮類、糖類、無機元素纖維素和維生素等， 2002年3月5日國家衛(wèi)生部(現(xiàn)衛(wèi)健委)將其列入保健品名單。絞股藍的功能有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗心肌缺血缺氧和腦缺氧、脂代謝調(diào)節(jié)、腎臟和肝臟保護作用等， 但是關(guān)于絞股藍影響DN的免疫功能研究報道相對較少， 本次研究的目的就在于探討絞股藍在DN大鼠中對其免疫機能的影響， 從而為臨床應用提供相應的經(jīng)驗積累。

3.2 對免疫功能的影響 大鼠灌服絞股藍煎劑10 g/kg或30 g/kg， 連服 10 d， 可明顯增加脾臟重量 ， 體重亦比正常參考組明顯增加， 能明顯促進單核巨噬細胞系統(tǒng)對血中膠體碳粒的廓清速率， 提高單核細胞的吞噬功能， 30 g/kg劑量亦可使胸腺重量增加［5］。

正常大鼠灌服絞股藍共50 mg/kg， 連服10 d， 對脾重呈雙相調(diào)節(jié)作用， 即對于小于中位數(shù)的脾重(mg/10 g體重)可使之增加， 大于中位數(shù)的脾重則使之減??；對胸腺重量(mg/10 g體重)小于中位數(shù)者無明顯影響， 大于中位數(shù)者亦可使之明顯減小。DN大鼠灌服絞股藍200 mg/kg或400 mg/kg， 連服10 d，可明顯對抗環(huán)磷酰胺引起的胸腺和脾臟重量減輕。小鼠灌服絞股藍水煎醇沉水提物0.5 g/kg、1.0 g/kg和2.0 g/kg， 連服5 d， 可增加胸腺重量， 1.0 g/kg及2.0 g/kg時才能增加脾重。DN大鼠灌服絞股藍400 mg/kg， 連服5 d， 對環(huán)磷酰胺所致胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)重量的減輕有明顯拮抗作用， 但對正常動物免疫器官重量則無明顯影響。

國外有研究表明， DN大鼠灌服絞股藍皂苷300 mg/kg，連服7 d， 對體重、脾臟和胸腺重量均無明顯影響， 但能顯著加強腹腔巨噬細胞吞噬功能［6］。α-半乳糖誘發(fā)的小鼠亞急性衰老模型， 灌服3%絞股藍浸膏(含生藥150%)混懸液， 連服50 d， 可使明顯升高的白細胞總數(shù)、淋巴細胞的百分率降低至接近正常參考組；使降低的中性粒細胞百分率升高至接近正常參考組；DN大鼠胸腺萎縮， 脾重增加， 用藥后胸腺指數(shù)恢復， 脾指數(shù)也恢復正常；DN組血清溶菌酶含量顯著降低，提示機體抗感染力下降， 服藥組溶菌酶含量顯著增加并超過DN大鼠組， 這提示應用絞股藍后DN大鼠免疫機能得到改善。

除了研究免疫指標與免疫器官指數(shù)外， 還通過酶聯(lián)吸附法動態(tài)測定了實驗大鼠IL-2分泌情況， 應用不同劑量的絞股藍大鼠可發(fā)生不同的免疫應激反應， 10 μg/ml應用絞股藍時，大鼠脾臟和淋巴細胞可在刀豆蛋白A和脂多糖誘導下增殖，當劑量提高到200 μg/ml時大鼠脾淋巴細胞自發(fā)性增殖。

3.3 關(guān)于絞股藍的毒理研究 雖然在研究中發(fā)現(xiàn)絞股藍對免疫機能的改善功能具有劑量依賴特征， 但為探究絞股藍的毒理作用， 進一步增加絞股藍使用量， 當增加至1000 mg/kg時(灌服)， 實驗大鼠未在72 h內(nèi)死亡， 隨著給藥方式和劑量的調(diào)整， 可以確定腹腔注射的半數(shù)致死量為1850 mg/kg， 口服5 g/kg、10 g/kg均可見毒性， 且大鼠一般情況、體重增長、進食量、血、尿常規(guī)和病理組織學檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。

3.4 實驗總結(jié)和應用前景 本項目具有較充分的前期研究工作。在前期工作中已經(jīng)從絞股藍抗氧化應激， 抗腎臟纖維化， 及其對炎性因子的影響方面證實了其對DN有一定的治療作用， 為此次實驗積累一定經(jīng)驗。硬件條件：實驗室、實驗儀器設(shè)備齊全， 實驗用試劑充足， 研究人員具備足夠的專業(yè)知識， 實驗經(jīng)費充足。

綜上所述， 絞股藍在DN臨床中有良好的應用效果， 可有效改善患者免疫功能， 從而有利于患者身體健康和生活質(zhì)量的提高。