滿春花 糜自豪 孫樂(lè)樂(lè) 盧憲梅 王 川 王建文陳學(xué)超 劉永霞 陳聲利 劉 紅 張福仁1，

皮膚結(jié)核(Cutaneous tuberculosis, CTB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種慢性感染性疾病，占皮膚科門(mén)診量的0.034%～0.26%[1-5]，占結(jié)核病的比例小于1%～2%[6,7]。CTB臨床表現(xiàn)多樣[8]，診斷困難。CTB組織病理可呈現(xiàn)結(jié)核性肉芽腫，伴干酪樣壞死，有利于診斷，但由于機(jī)體免疫力強(qiáng)弱不同，干酪樣壞死可缺乏，甚至呈非特異性炎癥反應(yīng)[9,10]，因此CTB確診往往還需依賴于抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)、PCR等病原學(xué)方法?？顾崛旧舾行栽?～13.8%[11,12],且無(wú)法與其它分枝桿菌相鑒別[13]；細(xì)菌培養(yǎng)可進(jìn)行菌種鑒定，敏感性相應(yīng)提高[12,14]，但耗時(shí)長(zhǎng)，需9.5～17.3天[15-17]；隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展，基于MTB片段擴(kuò)增的PCR技術(shù)成為CTB診斷的有力工具，但普通PCR技術(shù)易受污染DNA的影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性[18]，在臨床應(yīng)用受限。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (Real time fluorescence quantitative PCR, qPCR)在結(jié)核中特異性達(dá)100%，敏感性達(dá)85%[19]，近年來(lái)越來(lái)越多的應(yīng)用于結(jié)核的診斷中。該技術(shù)應(yīng)用于CTB新鮮組織MTB的檢測(cè)中敏感性為24.5%～33.3%[12,14]。但CTB患者初診時(shí)往往會(huì)因臨床表現(xiàn)不典型，未留取新鮮組織用于qPCR檢測(cè)，而二次取材患者依從性差、亦增加患者負(fù)擔(dān)，既往研究已經(jīng)證實(shí)qPCR可應(yīng)用于系統(tǒng)結(jié)核石蠟包埋組織病原菌的檢測(cè)，敏感性為74.6%[20]。本文擬采用qPCR技術(shù)檢測(cè)CTB石蠟包埋組織及新鮮組織中的MTB，并初步比較在兩種組織中檢測(cè)的敏感性，以探討在CTB石蠟包埋組織中開(kāi)展MTB檢測(cè)的可行性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 新鮮組織樣本 2017年8月至2018年3月山東省皮膚病醫(yī)院病理科確診為CTB的新鮮組織樣本。所有參與研究的患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.1.2 石蠟包埋組織樣本 山東省皮膚病醫(yī)院病理科2012年1月至2018年3月確診為CTB的石蠟包埋組織樣本。

1.1.3 確診標(biāo)準(zhǔn) 所有確診樣本除臨床和病理符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》CTB診斷外[21]，還必須滿足下列條件一條以上且抗結(jié)核治療有效方可入組：有現(xiàn)癥其它臟器結(jié)核；PPD試驗(yàn)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性；T-SPOT.TB陽(yáng)性[22]。

1.2 DNA的提取

1.2.1 新鮮組織DNA的提取 從皮損中切取約0.3×0.3×0.3 cm3組織塊。在無(wú)污染的情況下，用手術(shù)刀切小碎塊，將小碎塊轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中。使用新鮮組織DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司，51306)提取組織DNA，最后將其溶解于AE溶解液中。

1.2.2 蠟塊組織DNA的提取 用蠟塊切片機(jī)切取13片6μm厚度蠟塊，即刻放入1.5 mL滅菌EP管內(nèi)。使用蠟塊組織DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen 公司，56404)提取DNA，最后將其溶解于ATE溶解液中。

1.2.3 DNA的質(zhì)控和濃度的標(biāo)準(zhǔn)化 我們應(yīng)用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Nano Drop 8000，美國(guó)Thermo Fisher公司)進(jìn)行了DNA濃度的檢測(cè)，確保提取的DNA質(zhì)量；濃度的標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)于濃度為50 ng/μL以上的標(biāo)本，我們用無(wú)菌的雙蒸水稀釋為50 ng/μL；對(duì)于濃度低于50 ng/μL的標(biāo)本，我們直接進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 qPCR檢測(cè) 應(yīng)用達(dá)安基因公司的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法，Cat.#DA-052)進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，其中包括模板DNA 2 μL，退火溫度為55℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40，操作在AB 7500熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 基本信息 患者基本信息及臨床診斷見(jiàn)表1。研究共納入確診CTB病例20例，包括尋常狼瘡(Lupus vulgaris，LV)11例和疣狀皮膚結(jié)核(Tuberculosis verrucosa cutis，TVC)9例。男12例，女8例，男女比率為1.5∶1，平均年齡為(51±13.1)歲。其中6例同時(shí)有新鮮組織和石蠟包埋組織(1例LV、5例TVC)，14例僅有石蠟包埋組織(10例LV和4例TVC)。全部確診病例中抗酸染色陽(yáng)性3例(1例LV、2例TVC)。

表1 全部樣本檢測(cè)結(jié)果

注：“+”代表陽(yáng)性，“-”代表陰性，“未做”代表未做此項(xiàng)檢查。

2.2 qPCR檢測(cè)結(jié)果 在6例新鮮組織中，3例(1例LV、2例TVC)qPCR檢測(cè)MTB陽(yáng)性，敏感性為50%(3/6)(表1)；20例石蠟包埋組織中，7例(4例LV、3例TVC)經(jīng)qPCR檢測(cè)MTB陽(yáng)性，敏感性為35%(7/20)。其中同時(shí)有新鮮組織和石蠟包埋組織的6例患者，2例在兩種組織中qPCR檢測(cè)MTB均為陽(yáng)性，1例新鮮組織為陽(yáng)性，石蠟包埋組織為陰性。

3例抗酸染色陽(yáng)性，敏感性為15%(3/20)。抗酸染色陽(yáng)性的病例qPCR敏感性為100%(3/3)，抗酸染色陰性的病例為29.4%(5/17)。

3 討論

CTB是一種古老的傳染性疾病，占結(jié)核病的比例小于1%～2%[6,7]。近年來(lái)結(jié)核的防治卓有成效，但隨著艾滋病感染率的升高和多耐藥菌株的增加[23]，2017年全球結(jié)核新發(fā)病例數(shù)仍為1000萬(wàn)例[24]，相應(yīng)地CTB的發(fā)病人數(shù)不容忽視。CTB臨床表現(xiàn)多樣，分類眾多。其中按皮損中MTB的多少，分為多菌型和少菌型[25]。多菌型CTB因皮損中含菌量多，抗酸染色可為陽(yáng)性；少菌型CTB皮損中含菌量少，抗酸染色多為陰性[26]，病原學(xué)診斷困難。我們的樣本僅有LV和TVC兩種少菌型,平均年齡為(51±13.1)歲,較文獻(xiàn)報(bào)道大[27,28]，抗酸染色的陽(yáng)性率為15%。

qPCR技術(shù)是一種新興的病原學(xué)檢測(cè)方法，相比PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量檢測(cè)的飛躍，目前廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域。其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，敏感性高、特異性好，近年來(lái)越來(lái)越多的應(yīng)用于結(jié)核的診斷中。qPCR技術(shù)應(yīng)用于CTB新鮮組織MTB的檢測(cè)中敏感性為24.5%～33.3%[12,14],然而由于CTB臨床表現(xiàn)多樣，誤診率高達(dá)50%～52.8%[28,29]，因而在初診病理取材時(shí)，初診醫(yī)生往往未想到留取新鮮組織用于qPCR檢測(cè)。當(dāng)組織病理提示可能為CTB的診斷，只能二次取材，但這不僅增加患者痛苦，而且依從性差，因此探討應(yīng)用石蠟包埋組織進(jìn)行qPCR檢測(cè)非常必要。

Nilgün Senturk認(rèn)為CTB石蠟包埋組織PCR的敏感性降低[30]。溫晶發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)新鮮組織qPCR的敏感性優(yōu)于石蠟包埋組織[31]。我們應(yīng)用達(dá)安基因公司的qPCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)經(jīng)前述入選標(biāo)準(zhǔn)確診的20例CTB的石蠟包埋組織和新鮮組織，總的敏感性為40%(8/20)，其中新鮮組織樣本敏感性為50%(3/6)，石蠟包埋組織樣本敏感性為35%(7/20)。與既往報(bào)道一致，新鮮組織檢測(cè)的敏感性高于石蠟包埋組織[31],但無(wú)論是對(duì)新鮮組織還是石蠟包埋組織檢測(cè)的敏感性均高于文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)新鮮組織檢測(cè)的敏感性，而且我們的病例只有少菌型，文獻(xiàn)中的病例同時(shí)包括少菌型和多菌型[12,14]。同時(shí)有新鮮組織和石蠟包埋組織的6例患者，2例在兩種組織中qPCR檢測(cè)MTB均為陽(yáng)性，1例新鮮組織qPCR檢測(cè)陽(yáng)性，石蠟包埋組織中qPCR檢測(cè)結(jié)果是陰性。石蠟包埋組織假陰性結(jié)果可能是由于MTB在皮損中的分布并不均勻[14]，或者是福爾馬林導(dǎo)致的核酸和蛋白質(zhì)交聯(lián)[32]、DNA降解導(dǎo)致的石蠟包埋組織的DNA提取效率下降。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道蠟塊樣本一般固定時(shí)間越久，擴(kuò)增效率越低，超過(guò)5年的樣本擴(kuò)增的效率明顯降低[33]。但我們有1例LV和1例TVC是固定5年以上的，檢測(cè)出了MTB。但樣本量較少，缺乏代表性。

抗酸染色是檢測(cè)結(jié)核桿菌的基本病原學(xué)方法，可應(yīng)用石蠟包埋組織進(jìn)行檢測(cè)，但對(duì)閱片人員的要求高，敏感性低，而且不能區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌、諾卡氏菌、棒狀桿菌[13]。我們的樣本抗酸染色敏感性為15%,低于qPCR檢測(cè)的敏感性。Mmed報(bào)道抗酸染色陽(yáng)性的樣本中PCR陽(yáng)性率為55.6%(5/9),抗酸染色陰性的樣本PCR結(jié)果均為陰性[34]。Tan報(bào)道抗酸染色陽(yáng)性(多菌型)的樣本PCR陽(yáng)性率為64.3%(9/14)。在少菌型CTB樣本中，TVC敏感性為55%，LV為60%[35]。我們的樣本所有抗酸染色陽(yáng)性的樣本qPCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。在抗酸染色陰性的樣本中敏感性為29.4%(5/17)，其中LV為30%(3/10),TVC為28.6%(2/7)。

我們的研究結(jié)果表明qPCR技術(shù)可應(yīng)用于CTB新鮮組織及石蠟包埋組織中MTB的檢測(cè)，較之抗酸染色等傳統(tǒng)技術(shù)，qPCR敏感性、特異性更高，可輔助CTB的早期確診。在臨床工作中，如初診考慮到CTB的診斷，建議病理取材時(shí)一并留取新鮮組織進(jìn)行qPCR檢測(cè)；如臨床表現(xiàn)不典型，在病理提示CTB診斷可能性時(shí)，利用石蠟包埋組織開(kāi)展qPCR檢測(cè)也是協(xié)助病原學(xué)診斷的一種重要方式。