李朋發(fā) ，楊龍，李桂龍 ，徐后娟，王玉軍，李忠佩

1 中國科學院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，南京市北京東路71號 210008；

2 中國科學院大學，北京市石景山區(qū)玉泉路19號 100049；

3 山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，泰安市岱宗大街61號 271018

煙草土傳病害嚴重危害我國的煙葉生產(chǎn)[1]。目前，對煙草土傳病害的研究主要集中在三個方面，一是煙草病原菌的致病機理[2-4]；二是植煙土壤微生物群落組成和多樣性[5-6]；三是煙草病害的綜合防治措施[7-9]。而對于煙草土壤微生物群落功能的研究則鮮有報道。弄清煙草土壤微生物群落功能有助于深入了解煙草發(fā)病機理。

煙草根際土壤微生物種類繁多，其中真菌是重要的組成部分。受限于技術(shù)手段，對煙草根際真菌群落的研究也基本上都集中在群落組成和多樣性上[10-11]。FUNGuild[12]是一個進行真菌功能比對的數(shù)據(jù)庫，不僅可對真菌的營養(yǎng)類型進行鑒定，還能對真菌進行具體的功能分類。FUNGuild在真菌群落研究中得到了較為廣泛的應(yīng)用[13-14]。本研究聯(lián)合使用Illumina高通量測序技術(shù)和FUNGuild軟件，研究了鐮刀菌根腐病煙株與未發(fā)病煙株根際土壤真菌群落的組成和功能，旨在深入了解鐮刀菌根腐病發(fā)生的土壤微生物學機理，為鐮刀菌根腐病的控制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地位于山東省臨沂市沂水縣（35°97′N，118°37′E），該地區(qū)年均氣溫為13.0℃，年均降水量875mm。樣地為坡地，坡頂為林地，坡中和坡底為多年撂荒的新墾煙地，土壤類型為僵心棕堰土。坡中煙地中的煙株大規(guī)模發(fā)病，經(jīng)鑒定為鐮刀菌根腐病，平均發(fā)病率在95%以上。坡底煙地中的未見鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株。坡中土壤基本理化性質(zhì)為：pH 6.41，有機碳8.42 g·kg-1，總氮 0.89 g·kg-1，總磷0.96 g·kg-1，總鉀17.21 g·kg-1，堿解氮 86.65 mg·kg-1，速效磷83.38 mg.kg-1，速效鉀 103.17 mg·kg-1；坡底土壤基本理化性質(zhì)為：pH 6.38，有機碳8.46 g.kg-1，總氮 0.92 g·kg-1，總磷0.97 g·kg-1，總鉀17.34 g·kg-1，堿解氮 84.75 mg·kg-1，速效磷85.64 mg·kg-1，速效鉀 105.83 mg.kg-1。坡中與坡底土壤在理化性質(zhì)上無顯著差異。

在坡中、坡底各分別隨機選擇3塊煙地，每個地塊分別隨機選取5株煙株，取煙株根際土并將同一地塊采集的根際土混合。將采集好的土壤樣本加冰袋低溫運輸至實驗室。將土樣分為兩部分，其中一部分立即放入-20℃冰箱保存，用于DNA提??；另一部分過2 mm篩并風干，研磨后過0.149 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.2 土壤DNA提取及PCR擴增

土壤DNA使用MP Fast?DNA試劑盒提?。∕P Biomedicals，CA，USA），提取方法參考試劑盒使用說明書。提取的DNA使用PowerClean?DNA Clean-up Kit（MoBio，CA，USA）進 行 純化。DNA濃度和純度使用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)過純化的DNA濃度 均 在30 ng·μL-1以 上，OD260/OD280均 在1.8-2.0之間，濃度和純度均符合ITS擴增要求。使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）的特異性引物（ITS1-F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA[15]/ ITS2-R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[16]）對6個DNA樣本分別擴增，PCR體系和條件參考Li的方法[17]。

1.3 Illumina測序及序列處理

使用Illumina MiSeq PE250測序平臺對擴增產(chǎn)物進行雙端測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過Flash[18]和Trimmomatic[19]進行拼接和質(zhì)控后，使用微生物生態(tài)學定量研究平臺（Quantitative Insights into Microbial Ecology ，QIIME）進行處理。使用UCLUST[20]軟件對各序列在97%的相似性水平下聚類操作分類單位（operational taxonomic units，OTUs），各個OTU的代表序列使用UNITE數(shù)據(jù)庫（https://unite.ut.ee/）進行物種信息比對[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

真菌的營養(yǎng)型、功能分組使用FUNGuild（1.0）軟件進行比對，大體步驟為：（1）將QIIME輸出的OTU表和物種信息表合并，將物種信息附加在OTU表的最后一列并命名為“taxonomy”；（2）將第（1）步得到的表格上傳到FUNGuild網(wǎng)站，開始比對；（3）比對完成后下載輸出結(jié)果到本地。輸出結(jié)果包含原始的OTU表并依據(jù)序列數(shù)量進行排序。輸出結(jié)果還包含物種的分類單位“Taxon”，物種分類級別“Taxon Level”，營養(yǎng)型“Trophic Mode”，功能分組“Guild”，可信度“Confidence”，生長形態(tài)“Growth Morphology”，特征“Trait”，備注“Notes”和比對信息來源“Citation/Source”。

OTU數(shù)、OTU相對豐度等使用R語言（3.4.3）進行聚類計算，主坐標分析（Principal coordinate analysis ，PCoA）、ANOSIM檢驗也通過R語言（3.4.3）進行。樣本的描述性分析、組間差異的顯著性分析使用SPSS 19.0中的獨立t檢驗完成。所有圖片均通過Origin（9.1）制作。顯著性檢驗水準均為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性比較

經(jīng)過質(zhì)控，6個樣本共得到184,782條高質(zhì)量序列。在97%的相似性水平下聚類OTU，每個樣本按照樣本最少序列數(shù)抽平到14,644條序列，6個樣本共聚類得到600個OTU，其中有444條代表序列通過UNITE數(shù)據(jù)庫比對可鑒定為真菌。

在綱水平下對各樣本的物種進行分類求和，得到各樣本在綱水平下的物種組成，如圖1所示。通過圖1可以看出，未發(fā)病（H）與鐮刀菌根腐?。⊿）煙株的根際真菌群落在物種組成上明顯不同。未發(fā)病煙株根際真菌群落中，散囊菌綱（Eurotiomycetes）為優(yōu)勢菌綱，平均占比為42.81%，糞殼菌綱（Sordariomycetes）次之，平均占比為13.97%。發(fā)病煙株根際真菌群落中則正好相反，糞殼菌綱（Sordariomycetes）平均占比為55.06%，糞殼菌綱（Sordariomycetes）平均占比為14.61%。發(fā)病煙株根際真菌群落中的傘菌綱（Agaricomycetes）和鳥綱菌綱（Orbiliomycetes）比例均顯著高于未發(fā)病煙株（P＜0.05），但是座囊菌綱（Dothideomycetes）的相對豐度在兩組真菌群落中無顯著差異（P＞0.05）。主坐標分析（PCoA）結(jié)果顯示，未發(fā)病和發(fā)病煙株根際真菌群落顯著分異。進一步通過ANOSIM檢驗發(fā)現(xiàn)，兩組煙株根際真菌群落的組間差異顯著大于組內(nèi)差異（P＜0.05）。

圖1 未發(fā)?。℉）和鐮刀菌根腐病（S）煙株根際真菌群落在綱水平上的組成Fig.1 Composition of rhizospheric fungal community in group H (unaffected tobacco) and group S (Fusarium root rot diseased tobacco)

圖2 兩組煙株根際真菌群落組成的主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of rhizosphere fungal communities of group H and group S

分別選取Shannon-Wiener指數(shù)、Chao1指數(shù)和Observed OTUs指數(shù)描述兩組煙株根際真菌群落的多樣性，結(jié)果如表1所示，未發(fā)病組的三種α多樣性指數(shù)（Alpha diversities）均顯著高于鐮刀菌根腐病組（P＜0.05），說明未發(fā)病煙株根際真菌群落的多樣性顯著高于鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株。

表1 兩組煙株根際真菌群落多樣性對比Table 1 Comparison of Alpha diversities of rhizosphere fungal communities between group H and group S

2.2 根際真菌群落營養(yǎng)型比較

根際FUNGuild數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，對兩組煙株根際真菌的營養(yǎng)型（trophic mode）進行分類統(tǒng)計，結(jié)果如圖3所示，未發(fā)病煙株根際真菌的營養(yǎng)型以腐生營養(yǎng)型（saprotroph）為主，平均占比46.10%，病理營養(yǎng)型（pathotroph）次之，平均占比22.85%；鐮刀菌根腐病煙株根際真菌的營養(yǎng)型則以病理營養(yǎng)型為主，平均占比54.64%，腐生營養(yǎng)型次之，平均占比12.88%。兩組煙株根際的病理營養(yǎng)型真菌和腐生營養(yǎng)型真菌的相對豐度均具有顯著性差異（P＜0.05）。兩組煙株根際的共生營養(yǎng)型真菌相對豐度均不足1%，但是未發(fā)病煙株根際的共生營養(yǎng)型真菌相對豐度顯著低于鐮刀菌根腐病煙株（P＜0.05）。另外，未發(fā)病煙株根際有相對更多的真菌營養(yǎng)型尚未鑒別。

圖3 兩組煙株根際真菌群落的營養(yǎng)型組成Fig.3 Trophic composition of rhizosphere fungi communities of group H and group S

2.3 根際真菌病原菌群落比較

在600個OTU中，共有21個OTU經(jīng)FUNGuild鑒定為植物病原菌（Plant pathogen），其中有6個OTU的鑒定結(jié)果可信度（Confidence Ranking）為“Possible”，因此僅對剩余15個鑒定結(jié)果可信度為“Probable”和“Highly probable”的高可信病原菌OTU進行分析。

15個高可信度的病原菌OTU分別來自12個菌屬，其中，鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉屬（Gibberella）和青霉菌屬（Penicillium）均有2個OTU被鑒定為高可信病原菌且鐮刀菌屬的兩個OTU均為腐皮鐮孢菌（F.solina），其它9個菌屬均僅有1個OTU被鑒定為高可信病原菌。在所有高可信病原真菌中，鐮刀菌占據(jù)絕對優(yōu)勢地位。在未發(fā)病組中，2個鐮刀菌OTU的序列數(shù)占病原菌序列總數(shù)的75.02%±10.67%，而在鐮刀菌根腐病組中，2個鐮刀菌OTU的序列數(shù)占病原菌序列總數(shù)的99.10%±0.80%。鐮刀菌根腐病煙株根際的鐮刀菌在序列數(shù)和相對豐度上均顯著高于未發(fā)病組（P＜0.05）。對兩組煙株根際高可信病原菌OTU進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖4所示。未發(fā)病煙株根際病原真菌相對豐度平均為1.12%，而鐮刀菌根腐病煙株根際病原真菌相對豐度則高達30.73%，差異顯著（P＜0.05）。

圖4 兩組煙株根際病原菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of rhizospheric pathogens of two groups

3 討論

根際微生物區(qū)系被稱為植物的第二基因組，對植物的生長發(fā)育有決定性的影響[22]。本研究分析了鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株與未發(fā)病煙株根際土壤的ITS測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種根際土壤的真菌群落組成有顯著差異，未發(fā)病煙株根際真菌多樣性顯著高于發(fā)病煙株，這與李小龍等對青枯病煙株根際真菌群落的研究結(jié)果相吻合[23]。鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根際真菌群落多樣性的降低，很可能是鐮刀菌在群落的種間競爭中占據(jù)優(yōu)勢，少數(shù)病原菌不斷積累并逐漸成為優(yōu)勢種，在這個過程中，相應(yīng)的部分有益菌因為競爭能力弱而被淘汰[24]，物種數(shù)減少，多樣性降低。

除群落組成和多樣性外，鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株與未發(fā)病煙株根際真菌的營養(yǎng)型組成也存在顯著差異。在未發(fā)病煙株根際，真菌以腐生營養(yǎng)型為主，病理營養(yǎng)型次之，而發(fā)病煙株根際真菌的營養(yǎng)型則以病理營養(yǎng)型為主，腐生營養(yǎng)型次之。病理營養(yǎng)型表示真菌通過傷害寄主細胞來獲取自身所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而腐生營養(yǎng)型則表示真菌通過分解死亡的寄主細胞來獲取營養(yǎng)物質(zhì)[25]。鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根際的病理營養(yǎng)型真菌顯著高于未發(fā)病植株，說明發(fā)病植株根際可能有更多的致病真菌，尤其是鐮刀菌，通過破壞根系細胞來維持自身生長，導致煙株根系組織遭到破壞，進而使病原菌能更加順利地從根系對煙株進行侵染，最終導致煙株發(fā)病。

分析結(jié)果顯示，發(fā)病煙株根際的病原菌相對豐度也顯著高于未發(fā)病煙株，2個鐮刀菌在發(fā)病煙株根際的病原菌中占據(jù)絕對的優(yōu)勢地位。鐮刀菌是煙草致病菌，可引發(fā)煙草的鐮刀菌根腐病[26]。其中，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄病鐮刀菌（F.solani）等是侵染煙草根系并引發(fā)根腐病的主要病原菌種[26-27]，主要通過傷害煙草的維管束組織和根系組織等來侵染煙草[27]。因此，聯(lián)合使用高通量測序與FUNGuild軟件，可以對土傳病害感病煙株的根際優(yōu)勢病原真菌群落進行準確的鑒定，同時也可提供豐富的、非優(yōu)勢的潛在病原真菌信息，這對揭示煙草土傳病害發(fā)生的土壤微生物學機理具有重要意義，也可為煙草土傳病害的防控提供科學參考。

4 結(jié)論

通過高通量測序與FUNGuild的聯(lián)合使用，對鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株與未發(fā)病煙株根際土壤中的真菌群落進行了研究，結(jié)果表明：（1）未發(fā)病煙株與發(fā)病煙株根際的真菌群落在組成上具有顯著差異，未發(fā)病煙株根際真菌多樣性顯著高于發(fā)病煙株；（2）發(fā)病煙株根際真菌的營養(yǎng)型以病理營養(yǎng)型為主，腐生營養(yǎng)型次之，而未發(fā)病煙株則正好相反；（3）發(fā)病煙株根際的病原菌相對豐度顯著高于未發(fā)病煙株，鐮刀菌在病原菌群落中占絕對優(yōu)勢地位。高通量測序與FUNGuild的聯(lián)用，可以對土傳病害感病煙株的根際優(yōu)勢病原真菌群落進行準確的鑒定，也可為煙草土傳病害的防控提供科學參考。