寧 娜 , 韓建軍 , 胡宇莉

(1.銅仁職業(yè)技術學院藥學院，貴州銅仁554300 ； 2.貴州省中獸藥工程研究中心 ，貴州銅仁554300 ； 3.重慶市動物疾病預防控制中心，重慶渝北401120)

甜地丁為豆科植物米口袋Gueldenstaedtiaverna(Georgi.) A.Bor. 的干燥全草，其性寒味甘、苦，具清熱解毒的功效，主治癰腫疔瘡、外耳道癤腫、闌尾炎等[1]。甜地丁主要含有槲皮素、木犀草素、芹菜素等黃酮類成分[2-3]。研究表明，槲皮素作為飼料添加劑可以提高雞生產性能及改善脂肪粗脂肪含量[4]、改善產蛋后期蛋殼品質[5]、促進吉富羅非魚幼魚生長及增強非特異性免疫能力[6]等。

微波協(xié)同酶法是將微波法和生物酶結合起來進行中藥有效成分提取的一種聯(lián)用技術，即先利用酶解法充分破壞植物細胞壁，再利用微波法促進細胞內有效成分溶出[7]。目前微波協(xié)同酶法已被應用于艾葉[8]、金櫻子[9]、生姜[10]等天然植物有效成分的提取中。微波協(xié)同酶法在甜地丁槲皮素提取中的應用尚未見報道。本文探究了甜地丁槲皮素的微波協(xié)同酶法提取工藝，以期為該資源的進一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agiletn公司)；KQ-500DE臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA225D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；PHS-25型數(shù)字式顯示酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純；槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量為99.10%)；纖維素酶(寧夏和氏璧生物技術有限公司，酶活力為20 000 U/g)；果膠酶(寧夏和氏璧生物技術有限公司，酶活力為30 000 U/g)。

1.2 藥材 甜地丁藥材，購自安徽亳州中藥材市場，產地為安徽，經銅仁職業(yè)技術學院藥學院梁玉勇教授鑒定為豆科植物米口袋Gueldenstaedtiaverna(Georgi) A. Bor.的干燥全草。

1.3 試驗方法

1.3.1 槲皮素的HPLC測定 參照《中華人民共和國獸藥典》[11]進行槲皮素含量測定。采用 Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50 ∶50)；流速為1.0 mL/min；檢視波長為360 nm；柱溫為25 ℃；進樣量10 μL。

1.3.2 微波協(xié)同酶法提取槲皮素的工藝設計 甜地丁的提取按照以下流程進行：甜地丁→干燥、粉碎過40目篩→酶解→微波提取→減壓濃縮至100 mL→槲皮素提取液。根據(jù)文獻報道[12]及前期預試驗結果，確定微波提取條件為：加入20倍量70%乙醇，在微波功率為400 W條件下微波提取5 min。

1.3.3 槲皮素得率的計算 精密吸取槲皮素提取液0.2 mL至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，參照1.3.1的色譜條件對提取液中槲皮素含量進行測定，并根據(jù)峰面積計算槲皮素得率。槲皮素得率按照如下公式進行計算：槲皮素得率(mg/g)=提取液中槲皮素含量(mg)/甜地丁藥材質量(g)。

1.3.4 微波協(xié)同酶法提取槲皮素的工藝優(yōu)化 通過單因素試驗分別考察酶種類、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間及酶用量對槲皮素得率的影響。在單因素試驗基礎上，進行正交試驗設計來優(yōu)化微波協(xié)同酶法提取槲皮素的工藝條件。

2 結果與分析

2.1 槲皮素的HPLC測定結果 按照1.3.1的色譜條件，分別對槲皮素對照品及甜地丁藥材進行測定，得到色譜圖如圖1所示。峰面積Y與槲皮素濃度X(μg/mL)之間的回歸方程為：Y=424 750.49X-343 791.41, R2=0.999 9。結果表明，槲皮素濃度在5～160 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 槲皮素對照品(A)和甜地丁藥材(B)的高效液相色譜圖

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶的種類 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解溫度45 ℃、酶解時間70 min，酶用量0.8%條件下，考察酶種類(纖維素酶、果膠酶、纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1、纖維素酶 ∶果膠酶=1∶1、纖維素酶∶果膠酶=1∶2)對槲皮素得率的影響。試驗結果見圖2。

由圖2可知，復合酶較單一酶組的槲皮素得率高，復合酶中當纖維素酶與果膠酶按照2 ∶1的比例組合時，槲皮素得率最高。因此后續(xù)試驗選用復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)對甜地丁藥材進行酶解處理。

2.2.2 酶解pH值 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解溫度45 ℃、酶解時間70 min，復合酶(纖維素酶∶果膠酶=2∶1)用量0.8%條件下，考察酶解pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)對槲皮素得率的影響。試驗結果見圖3。

圖2 酶種類對槲皮素得率的影響

圖3 酶解pH值對槲皮素得率的影響

由圖3可知，當pH值為4.5時，槲皮素得率最高。當pH值高于4.5時或低于4.5時，均影響復合酶的活性。因此，選擇酶解pH值4.5左右。

2.2.3 酶解溫度 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解時間70 min，復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%條件下，考察酶解溫度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)對槲皮素得率的影響。試驗結果見圖4。

圖4 酶解溫度對槲皮素得率的影響

由圖4可知，當溫度為45 ℃時，槲皮素得率最高。當溫度高于45 ℃時或低于45 ℃時，均影響復合酶的活性。因此，選擇酶解溫度45 ℃左右。

2.2.4 酶解時間 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解溫度45 ℃，復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%條件下，考察酶解時間(30 min、50 min、70 min、90 min、110 min)對槲皮素得率的影響。試驗結果見圖5。

圖5 酶解時間對槲皮素得率的影響

由圖5可知，槲皮素得率隨著酶解時間延長而增長。當酶解時間達到70 min后，繼續(xù)延長酶解時間，槲皮素得率的增長趨勢趨于平緩。因此，選擇酶解時間70 min左右。

2.2.5 復合酶用量 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解溫度45 ℃，酶解時間70 min條件下，考察復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)對槲皮素得率的影響。試驗結果見圖6。

圖6 復合酶用量對槲皮素得率的影響

由圖6可知，隨著復合酶用量的增加，促進對甜地丁植物細胞壁的破壞，槲皮素得率不斷增加，當復合酶用量為0.8%時，槲皮素得率達到最高。隨著進一步增加酶用量，過多的復合酶包裹于植物細胞壁外側，阻礙槲皮素的溶出，使得槲皮素得率呈下降趨勢。因此，選擇復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%左右。

2.3 正交試驗結果 根據(jù)單因素試驗結果，選擇酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)、復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量(D)4個因素，以槲皮素得率為考察指標，按照L9(34)正交表進行試驗，因素水平安排見表1，正交試驗的結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平

表2 微波協(xié)同酶法提取甜地丁槲皮素正交試驗分析

表3 槲皮素得率方差分析

由表3可知，各因素對槲皮素得率的影響順序為A>C>D>B，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：A2B3C2D2，即：酶解pH值4.5，酶解溫度50 ℃，酶解時間70 min，復合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%。由表3可知，酶解pH值對槲皮素得率影響顯著，其他3個因素均無顯著性影響。

2.4 驗證試驗 按照上述優(yōu)化的工藝條件，平行3次驗證試驗，結果槲皮素的平均得率為1.20 mg/g(RSD=0.96%)，高于正交試驗設計中的9組槲皮素得率數(shù)值，表明該工藝穩(wěn)定、可行，可作為微波協(xié)同酶法提甜地丁槲皮素的最佳工藝條件。

3 結論

本研究通過單因素試驗和正交試驗設計對微波協(xié)同酶法提取甜地丁槲皮素的工藝進行了優(yōu)化。試驗結果表明：酶解pH值對槲皮素得率的影響達到顯著性水平，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：酶解pH值4.5，酶解溫度50 ℃，酶解時間70 min，復合酶(纖維素酶∶果膠酶=2∶1)用量0.8%。驗證試驗結果顯示：在優(yōu)化的工藝條件下，槲皮素得率達到1.20 mg/g。該工藝條件穩(wěn)定、可行，可作為微波協(xié)同酶法提取工藝條件，為甜地丁槲皮素的工業(yè)化生產提供一定的數(shù)據(jù)參考，為甜地丁資源的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。