李勁松，唐建華，向陽鴻

(1.桂林市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西桂林541001 ； 2.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 ，重慶榮昌402460 ； 3.重慶方通動物藥業(yè)有限公司，重慶榮昌402460)

近幾年，仔豬的腹瀉病成為臨床中常見的疾病之一，主要由傳染性病原感染以及非傳染性因素等引起，傳染性因素包括細(xì)菌、病毒以及其他病原的感染，其中細(xì)菌引起的仔豬腹瀉在仔豬感染性腹瀉中占有較大比重，尤其致病性大腸桿菌和沙門菌引起的仔豬腹瀉臨床中最為常見，其感染率和死亡率均較高，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。致病性大腸桿菌可以引起家畜、家禽等多種動物及人發(fā)病，為重要的人獸共患病原菌。仔豬大腸桿菌病是由某些致病性血清型大腸桿菌引起仔豬腹瀉的一類傳染性疾病的總稱，根據(jù)其致病性大腸桿菌的病原類型、臨床癥狀表現(xiàn)、病理剖檢及流行病學(xué)特征的不同，可以分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，其中，臨床上以仔豬黃白痢發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1-2]。由于大腸桿菌血清型眾多，給疫苗的研制帶來很大困難，抗生素成為防治大腸桿菌主要手段，在養(yǎng)豬的過程中抗生素不合理的使用，產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，降低了治療效果，同時造成豬肉等畜產(chǎn)品中嚴(yán)重的藥物殘留，威脅人類的健康，應(yīng)引起重視[3]。

本試驗(yàn)從桂林地區(qū)不同養(yǎng)豬場中，采集患腹瀉仔豬肝臟、肛拭子及糞便等病料組織，共分離到67株大腸桿菌，對分離的67株大腸桿菌的致病性、血清型及耐藥性進(jìn)行分析，為該地區(qū)的仔豬腹瀉性大腸桿菌病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 桂林地區(qū)不同養(yǎng)豬場無菌采集的患腹瀉病仔豬肝臟、肛拭子及糞便等病料組織樣品103份。

1.2 試劑與儀器 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭染色試劑盒購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；E.coli標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；ID32E腸桿科菌鑒定試劑條購自法國梅里埃生物技術(shù)公司； ATB自動生化鑒定系統(tǒng)儀由法國梅里埃生物技術(shù)公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱由上海經(jīng)濟(jì)區(qū)沈蕩中新電器有限公司生產(chǎn)；多功能梯度 PCR儀(VeritiTm 96-Well Thermal型)由美國 ABI 公司生產(chǎn)；常規(guī)的儀器及試劑均由桂林市動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室以及重慶方通動物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 (25±2)g昆明系小鼠340只，購自重慶方通動物藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集的患病仔豬肝臟、肛拭子和糞便等病料組織樣品103份接種麥康凱培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18 h，選取單個優(yōu)勢菌落接種于鑒別培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)平板上培養(yǎng)，挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)， 37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)12 h后，革蘭染色觀察分離菌株的形態(tài)學(xué)。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)鑒定 按照ID32E腸桿科菌鑒定試劑條說明書，將純化培養(yǎng)后的分離菌株通過比色法調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫?，加入ID32E腸道菌鑒定試條中 37 ℃培養(yǎng)12-24 h，用ATB自動生化鑒定系統(tǒng)儀對分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定及測序 參考文獻(xiàn)[4]，設(shè)計(jì)細(xì)菌的16S rRNA基因序列通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，由華大生物工程有限公司合成。用水煮法制備分離菌株的基因組DNA模板，對分離菌株進(jìn)行PCR鑒定。 PCR增反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqMarker Mix 25 μL，引物P1、P2各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃終延伸10 min，共30個循環(huán)。用1%瓊脂糖檢測分離菌株的目的條帶后，將分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的基因序列進(jìn)行同源性比較。

2.4 致病性試驗(yàn) 將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL；每1株分離菌株攻毒5只小鼠，每只小鼠通過灌胃的方式攻毒，劑量為0.25 mL(108CFU/mL)，空白對照組用同樣方法給予等量的營養(yǎng)肉湯；腹腔注射等量的滅菌的生理鹽水。在攻毒12 h后，觀察7 d，記錄每個試驗(yàn)組小鼠的發(fā)病及死亡情況，并對于死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2.5 分離株血清型鑒定 參考文獻(xiàn)[5]，用E.coli標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)檢測致病性大腸桿菌的血清型。

2.6 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行操作，結(jié)果判斷。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出邊緣光滑整齊的、濕潤的、粉紅色扁圓的菌落；在伊紅美蘭培養(yǎng)基上長出深紫黑色或者褐色并帶金屬光澤、圓形菌落；革蘭染色為陰性、兩端鈍圓的桿狀菌。與報(bào)道的大腸桿菌培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)一致。通過統(tǒng)計(jì)103份樣品中67株分離菌株疑似大腸桿菌。

3.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果 分離菌株V-P試驗(yàn)為均陰性、吲哚試驗(yàn)均為陽性，能發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；將培養(yǎng)的ID32E腸桿科菌鑒定試劑條放入ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定分析，結(jié)果顯示，67株分離菌株均鑒定為大腸桿菌，系統(tǒng)評定合格率在98.9%～99.9%之間。67株分離菌株生化特性與報(bào)道的大腸桿菌的生化特性一致。

3.3 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果 用細(xì)菌的16S rRNA基因序列通用引物對分離菌株進(jìn)行了PCR鑒定，67株分離菌株均擴(kuò)增出大約為1 492 bp左右的目的基因的條帶(見圖1)。67分離菌株測序結(jié)果后與GenBank中登錄的參考株大腸桿菌的基因序列同源性在98.9%～99.9%之間，因而證實(shí)了67株分離菌株為大腸桿菌。

圖1 部分分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

M:DL-2 000 Marker ; 1-7:分離菌株

3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組攻毒的小鼠在攻毒后的48-72 h出現(xiàn)不同程度的死亡，在死亡的小鼠肝臟組織中分離到大腸桿菌。直到試驗(yàn)結(jié)束(7 d)，對照組5只小鼠未出現(xiàn)明顯的變化。通過致病試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與分析，67株分離菌中52株大腸桿菌分離株對小鼠致死率為100%，為致病性大腸桿菌。

3.5 血清型檢測結(jié)果 結(jié)果見表1。52株仔豬致病性大腸桿菌分離株共包括屬于12個血清型，定型菌株為52株，占分離菌株的77.6%(52/67)；其中，以O(shè)149、O109和O9為流行的優(yōu)勢血清型，分別占仔豬致病性分離菌株的21.2%、15.4%、13.5%和11.5%。

表1 52株致仔豬腹瀉性大腸桿菌血清型檢測結(jié)果

3.6 耐藥性分析結(jié)果 結(jié)果見表2。52株仔豬致病性大腸桿菌分離株存在著嚴(yán)重的耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥。對阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素3種藥物的耐藥率最高，高達(dá)100%；對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氨芐西林3種藥物的耐藥率在88.4%～98.1%之間；對阿米卡星、林可霉素、慶大霉素、多粘菌素、強(qiáng)力霉素、大觀霉素6種藥物的耐藥率在51.9%～75.0%之間；對頭孢克肟、頭孢他啶、氟苯尼考3種藥物耐藥性在23.1%～48.1%之間。

表2 52株致仔豬腹瀉性大腸桿菌耐藥性分析結(jié)果

4 討論

仔豬大腸桿菌病為養(yǎng)豬過程中常見的細(xì)菌性傳染病之一，該病可以引起仔豬嚴(yán)重腹瀉，導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重生長發(fā)育受阻，增重緩慢，臨床中引起仔豬黃白痢大腸桿菌主要是腸毒素性大腸桿菌(ETEC)，感染率和死亡率較高，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展[6]。近幾年，關(guān)于致病性大腸桿菌引起仔豬腹瀉的報(bào)道越來越多，應(yīng)引起重視。本試驗(yàn)從桂林地區(qū)不同的養(yǎng)殖場中，采集了103份患腹瀉仔豬肝臟、肛拭子和糞便等病料組織樣品中分離到了52株致病性大腸桿菌，從而證實(shí)了桂林地區(qū)不同的養(yǎng)殖場中致仔豬腹瀉性大腸桿菌廣泛流行，應(yīng)引起重視并進(jìn)行合理的防治。

由于大腸桿菌血清型眾多，具有多樣流行性，不同血清型間菌株之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)性，目前沒有理想疫苗對該病進(jìn)行預(yù)防[5]。因此，導(dǎo)致仔豬致病性大腸桿菌流行。本試驗(yàn)分離的52株仔豬致病性大腸桿菌屬于12個血清型，其中，以O(shè)149、O109和O9為流行的優(yōu)勢血清型。從而證實(shí)該地區(qū)仔豬致病性大腸桿菌流行的血清型復(fù)雜，具有多樣性。吳利軍等[6]報(bào)道了湖北地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場中仔豬腹瀉性大腸桿菌的流行血清型以O(shè)4、O55、O119為主。孫曉鍇[7]報(bào)道了重慶地區(qū)的仔豬源大腸桿菌流行的血清型為O101、O8、O20、O64、O45、O149。王鵬等[8]報(bào)道了四川地區(qū)豬水腫病致病性大腸桿菌以O(shè)139主要的流行血清型。仔豬腹瀉性大腸桿菌的流行血清型與地區(qū)有關(guān)，不同地區(qū)分離的大腸桿菌流行的血清型也不同，其致病性也存在一定的差異性。

大腸桿菌具有易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，由于抗生素的不合理的使用，造成嚴(yán)重的耐藥性，且耐藥譜型不斷的增大。本試驗(yàn)?zāi)退幮苑治鼋Y(jié)果表明，52株仔豬致病性大腸桿菌分離株存在著嚴(yán)重的耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥。對阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素3種藥物的耐藥率高達(dá)100%；對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氨芐西林3種藥物的耐藥率在88.4%～98.1%之間；對其他藥物耐藥率在在51.9%～75.0%之間；對頭孢克肟、頭孢他啶、氟苯尼考3種藥物耐藥性相對較低，在23.1%～48.1%之間。與吳利軍等[6]、郭瀟木等[9]、馬長賓等[10]的報(bào)道存在一定差異性，可能與地區(qū)流行的致病性大腸桿菌有關(guān)，還可能與用藥情況有關(guān)。因此，當(dāng)仔豬發(fā)生該病時，應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，合理使用藥物預(yù)防與治療，提高治療效果，同時要加強(qiáng)平時的飼養(yǎng)管理。