王亞麗，田 曼，李 江，王昌利，葛人杰，李 歡，王 媚，顏永剛，張 崗

(陜西中醫(yī)藥大學 藥學院，陜西 西安 712046)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge. var. mongholicus ( Bge.) Hsiao 或莢膜黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge 的干燥根[1]。中藥黃芪是我國最常用的大宗中藥材之一，具有補氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌的功效，是補氣要藥，在中藥中被譽為“補氣圣藥”?，F代醫(yī)學研究發(fā)現，黃芪中主要含有皂苷類、黃酮類、黃芪多糖、氨基酸、生物堿及微量元素等多種有效成分，具有增強免疫系統、抗氧化、延緩衰老、抗病毒等作用[2]。其中黃芪總皂苷是黃芪中主要的一類活性物質，具有降血壓、降血糖、改善胰島素抵抗活性、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗風濕、抗腫瘤、保護心臟等生物活性[3-8]。本實驗在對黃芪中6種皂苷成分提取方法、提取溶劑進行初篩的基礎上，以黃芪甲苷，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量為評定指標，采用綜合評分與正交實驗設計相結合優(yōu)選黃芪皂苷最佳提取工藝條件，為黃芪皂苷成分的客觀評價提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀系列：Empower pro色譜工作站，在線脫氣機，四元高壓梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，Waters 2420 ELSD Detector檢測器；KQ-2500E數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱(上海博迅有限公司醫(yī)療設備廠)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；FW177中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；標準檢驗篩(45目，孔徑0.40mm)，浙江恒幸儀器設備制造有限公司。

1.2 試藥

對照品黃芪甲苷(批號10212-201603)、黃芪皂苷Ⅲ(批號10215-201611)、黃芪皂苷Ⅱ(批號10214-201701)、異黃芪皂苷Ⅱ(批號20417-201701)、黃芪皂苷Ⅰ(批號10213-201610)、異黃芪皂苷Ⅰ(批號20416-201605)均購自南昌貝塔生物科技有限公司，質量分數均≥98%。黃芪Astragali Radix藥材采自步長集團宕昌縣黃芪種植基地，經陜西中醫(yī)藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranace-us(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。實驗用水為娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司生產；乙腈和甲醇均為色譜純，購自美國賽默飛世爾科技有限公司；冰醋酸(色譜純)，天津市科密歐化學試劑有限公司。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法

建立同時測定黃芪中6種皂苷成分含量的HPLC方法。

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫 25 ℃；流動相為 0.3% 冰醋酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～12 min，18% B；12～35 min，18% B→30% B；35～43 min，30% B；43～60 min，30% B→55% B；60～70 min，55% B→70% B；70～80 min，70% B→100%B；系統平衡時間 20 min；流速 1.0 mL/min；進樣量 10 μL；蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度 60 ℃，噴霧器溫度 36 ℃，增益值 130，供氣壓力 80 psi。對照品及樣品的液相色譜見圖1。

t/min

注：1.黃芪甲苷;2.黃芪皂苷Ⅲ; 3.黃芪皂苷Ⅱ;4.異黃芪皂苷Ⅱ; 5.黃芪皂苷Ⅰ; 6.異黃芪皂苷Ⅰ

圖1 混合對照品溶液D(A)及樣品(B)的HPLC-ELSD色譜

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定對照品黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ適量，用甲醇超聲溶解制成含有100 μg/mL黃芪甲苷、500 μg/mL黃芪皂苷Ⅲ、200 μg/mL黃芪苷Ⅱ、80 μg/mL異黃芪皂苷Ⅱ，1 300 μg/mL黃芪皂苷Ⅰ、520 μg/mL異黃芪皂苷Ⅰ的混合對照品溶液C；精密稱定對照品黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ適量，用甲醇超聲溶解制成含有60μg/mL黃芪甲苷、270μg/mL黃芪皂苷Ⅲ、100 μg/mL黃芪皂苷Ⅱ、50 μg/mL異黃芪皂苷Ⅱ、650 μg/mL黃芪皂苷Ⅰ、250 μg/mL異黃芪皂苷Ⅰ的混合對照品溶液D。分別將混合對照品溶液C、D放于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 將黃芪藥材于50 ℃干燥24 h，打粉，過45目篩，精密稱量粉末5.0 g，置500 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇200 mL，浸泡12h后，加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液蒸干，加入100 mL水溶解殘渣，將溶液轉移到分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次200 mL，棄去石油醚層，將非石油醚層轉移到蒸發(fā)皿中，濃縮干燥，加甲醇定容到10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)慮液，即得。

2.1.4 線性關系考察 將“2.1.2”項下混合對照品溶液D按“2.1.1”色譜條件依次進樣2 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、16 μL，重復測定3次，以進樣量的對數為橫坐標(X)，峰面積的對數(Y)為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 6種皂苷類成分的線性關系與線性范圍

2.1.5 精密度試驗 取混合對照品溶液D，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣量10 μL，計算黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為1.62%、2.01%、1.59%、1.98%、2.29%、2.36%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性考察 依據最優(yōu)提取工藝，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為2.25%、2.21%、1.72%、2.10%、2.83%、2.41%，結果表明本實驗的重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取最優(yōu)提取工藝所得供試品溶液，分別在制備后的0、4、8、12、16、24 h各進樣1次，每次進樣量10 μL，測定黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為2.09%、2.15%、2.77%、2.26%、2.53%、2.64%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率 精密稱定同一批已知含量的黃芪粉末1.0 g，共6份，分別精密加入混合對照品溶液C1.0 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，進樣量15 μL。結果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的平均回收率依次為102.75%、98.89%、96.91%、100.06%、99.34%、96.68%，RSD依次為2.48%、1.75%、2.16%、2.68%、2.76%、2.59%。

2.2 黃芪中6種皂苷成分提取工藝研究

2.2.1 提取方法考察 (1)超聲提取法：精密稱取黃芪粉末:5.0g，置500mL的錐形瓶中，精密加入甲醇200mL，浸泡12h后，超聲提取1次，提取1h，即得超聲提取液。

(2)回流提取法：精密稱取黃芪粉末5.0 g，置500 mL的圓底燒瓶中，精密加入甲醇200 mL，浸泡12 h后，加熱回流提取1次，提取1 h，即得回流提取液。

將上述兩種提取方法所得提取液按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，從6種皂苷類成分的總提取量來看，甲醇回流法提取量較高。結果見表2。

表2 不同提取方法對6種皂苷類成分總提取量的影響 (mg·g-1)

2.2.2 提取溶劑考察 精密稱取黃芪粉末5.0 g，置500 mL的圓底燒瓶中，精密加入提取溶劑200 mL，浸泡12 h后，加熱回流提取時間1 h，提取1次，考察80%甲醇與不同體積分數乙醇(80%、90%、95%)提取對黃芪中6種皂苷類成分含量的影響。結果表明甲醇比乙醇更適合用來提取黃芪中這6種皂苷類成分。結果見表3。

表3 不同提取溶劑對6種皂苷類成分總提取量的影響 (mg·g-1)

2.2.3 醇提工藝的因素和水平優(yōu)化 以上試驗表明選用80%甲醇加熱回流提取黃芪中6種皂苷類成分較合適，為優(yōu)化甲醇回流提取工藝，對甲醇體積分數(因素A)、提取時間(因素B)及提取次數(因素C)進行了3因素3水平的正交試驗。因素水平見表4。

表4 正交試驗因素水平

精密稱取黃芪粉末各5.0 g，按照L9(34)正交試驗設計表中確定的條件進行實驗，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，分別計算這6種皂苷類成分的含量，并進行多指標綜合評分。評分時以各指標的最大值為參照對數據進行歸一化，再給出各指標的權重。賦予指標權重采用專家評分法，即同行專家依據黃芪中這6種皂苷類成分在黃芪總皂苷提取工藝整體評價中的相對重要程度，獨立給出各指標的權重系數；查閱近10年來黃芪藥材中黃芪皂苷類成分提取工藝以及含量測定相關文獻107篇，其中83篇檢測了黃芪甲苷，18篇檢測了黃芪皂苷Ⅲ，22篇檢測了黃芪皂苷Ⅱ，20篇檢測了黃芪皂苷Ⅰ，4篇檢測了異黃芪皂苷Ⅱ，2篇檢測了異黃芪皂苷Ⅰ。將專家評分法與各指標在近10年來黃芪皂苷類成分提取工藝以及含量測定相關文獻中被檢測的頻率統計相結合對各指標設定權重，同時，鑒于黃芪甲苷是黃芪中增強機體免疫的主要有效成分之一[9]，并通常作為評價黃芪藥材及制劑質量的常用指標性成分，故本實驗取權重系數分別為：黃芪甲苷權重為0.6，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ權重均為0.1，異黃芪皂苷Ⅰ權重為0.04、異黃芪皂苷Ⅱ權重為0.06。按照下列公式求出綜合評分值(Y)，以綜合評分值進行統計分析。正交試驗安排及結果見表5，方差分析見表6。

Yi=0.6X/0.1212+0.1×(Z/0.6447+M/0.2751+N/1.6691)+0.06P/0.1134+0.04Q/0.6020，(X為黃芪甲苷含量、Z為黃芪皂苷Ⅲ含量、M為黃芪皂苷Ⅱ含量、N為黃芪皂苷Ⅰ含量、P為異黃芪皂苷Ⅱ含量、Q為異黃芪皂苷Ⅰ含量)，i=1,2,3,.....9。

表5 正交試驗結果 (mg·g-1)

表6 正交試驗方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00。

2.2.4 正交試驗結果分析 以綜合評分值為標準，由表5直觀分析可知，在所選因素水平范圍內，各因素的作用主次順序為A(提取溶劑體積分數)>C(提取次數)>B(提取時間)，理論上以A1B2C3為最優(yōu)組合，即80%甲醇回流提取3次，每次提取2 h。由表6方差分析結果表明，因素A(甲醇體積分數)和因素C(提取次數)均為主要影響因素，對各指標成分的提取有顯著性影響(P<0.05)，因素B(提取時間)對提取結果不具有顯著性影響(P>0.05)，由于提取時間對試驗結果的影響經統計學檢驗不具有顯著性，為了降低成本、節(jié)約時間、提高效率，故最終確定最優(yōu)組合為A1B1C3，即80%甲醇回流提取3次，每次提取1 h。

2.2.5 正交驗證試驗 為進一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份藥材按篩選得到的最佳提取工藝A1B1C3進行正交驗證試驗，結果黃芪甲苷，黃芪皂苷Ⅲ、Ⅱ，異黃芪皂苷Ⅱ，黃芪皂苷Ⅰ，異黃芪皂苷Ⅰ的平均提取量分別為0.1098、0.4783、0.2694、0.1256、1.4356、0.5496mg·g-1，RSD值均小于2.74%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 流動相的選擇

在實驗前，通過查閱大量文獻發(fā)現，HPLC-ELSD法測定黃芪皂苷類成分含量時選用的流動相主要有乙腈-酸水溶液[10-12]和乙腈-水[13-17]洗脫系統，經實驗考察，乙腈-0.3%冰醋酸作為流動相時，基線噪音小，色譜峰的分離度、峰形均優(yōu)于乙腈-0.3%甲酸溶液和乙腈-水，由于考慮到酸性洗脫系統對色譜柱的損害，為保護色譜柱，所以適當降低冰醋酸濃度，但隨著冰醋酸濃度的降低，色譜峰靈敏度亦隨著變低，故本實驗最終采用乙腈-0.3%冰醋酸溶液作為流動相。

3.2 評價指標的選擇

通過查閱文獻，黃芪中黃芪甲苷，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ等皂苷類成分具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗衰老、抗炎和免疫調節(jié)等藥理作用。采用單一指標成分進行工藝優(yōu)選與中藥多組分、多靶點的作用特點有一定偏離，考慮到單一成分作為中藥提取工藝評價指標的局限性，故本實驗以黃芪中6種皂苷類成分的含量作為研究指標。

3.3 數據處理分析

據文獻報道，黃芪皂苷提取主要以總皂苷或黃芪甲苷工藝篩選為主，涉及的成分過于籠統或單一，考慮其藥理作用較少。故本實驗采用多指標綜合評分法結合正交試驗設計來篩選黃芪中6種皂苷類成分最佳提取工藝。不僅利用正交試驗方法進行相關因素和水平的考察，同時也考慮到了黃芪甲苷和其他5種具體的皂苷成分的含量和藥理作用。采用多指標的正交試驗設計進行工藝優(yōu)選時，首先需要針對指標間的重要性差異給各指標設定權重系數，進行綜合評分后再做統計分析。本實驗從專家評分和近10年來相關文獻統計情況兩方面考慮，最后給出各指標權重，這樣進行統計分析優(yōu)選出的工藝更具有科學性和合理性，為后期黃芪的進一步開發(fā)利用提供了實驗參考。