何枝華，彭夢(mèng)媛，王穎芳，2*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510006)

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，是發(fā)病率和死亡率極高的臨床綜合征，全球每年有數(shù)百萬(wàn)人罹患膿毒癥，其中25%甚至更多的患者死亡[1]。如何改善膿毒癥患者機(jī)體的免疫功能，降低病死率是目前亟待解決的問(wèn)題。中醫(yī)認(rèn)為感染屬于毒熱證范疇，病機(jī)為“熱毒熾盛”，而膿毒癥各個(gè)時(shí)期都可存在嚴(yán)重感染，使用清熱解毒法解決“毒邪”這一主要矛盾，可取得良好療效[2-5]。

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld. 的干燥全草。微苦、微甘、微寒，歸心、肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。臨床常用于治療闌尾炎、肝炎、泌尿系統(tǒng)感染、支氣管炎、扁桃體炎、喉炎等多種炎癥疾病，但其作用機(jī)理尚不明確，報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)觀察了白花蛇舌草提取物對(duì)膿毒癥小鼠炎癥的影響，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清炎癥因子水平和肝臟的病理學(xué)變化，探究其抑制膿毒癥小鼠炎癥可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠80只，雌雄各半，體重18～22g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041。

1.2 藥物與試劑

白花蛇舌草(廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院提供，提取物由實(shí)驗(yàn)室自制)；LPS(北京索萊寶科技有限公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院)；小鼠ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。

1.3 儀器

低溫高速離心機(jī)(德國(guó)HERMLE)；電子天平(日本Satorius)；酶聯(lián)分析儀(Tecan genio公司)；BH-2顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、建模及給藥

將80只小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松干預(yù)組和白花蛇舌草水提組、白花蛇舌草醇提組，地塞米松干預(yù)組和白花蛇舌草水提組、醇提組連續(xù)灌胃7天，其余各組給予等體積生理鹽水；末次給藥30 min后，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模，空白組給予等體積生理鹽水，1次/天持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2 指標(biāo)觀測(cè)

2.2.1 動(dòng)物臨床癥候觀察 造模后分別于6 h、12 h、24 h、48 h觀察各組小鼠體表癥狀，如精神、食欲、大小便、毛發(fā)色澤等。

2.2.2 血清炎癥因子檢測(cè) 于造模后6 h、12 h、24 h、48 h小鼠眼眶取血，分離血清備用，按ELISA試劑盒步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

2.2.3 肝臟組織病理觀測(cè) 分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h采用頸椎脫臼法處死小鼠，統(tǒng)一剪取肝左上葉置于中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色等操作后于光鏡下觀察病理變化。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠臨床癥候觀察

空白組小鼠反應(yīng)敏捷，精神、食欲、大小便均正常，毛發(fā)均勻光澤。模型組小鼠在造模6 h后開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，毛發(fā)蓬松不潔，寒顫發(fā)抖，大小便失禁，食欲下降等臨床癥候，12 h后癥狀開(kāi)始明顯加重。白花蛇舌草提取物組造模后同時(shí)間段也出現(xiàn)進(jìn)食減少、活動(dòng)量減少的癥狀，但呼吸、精神、毛發(fā)等情況均明顯優(yōu)于模型組，24 h后上述癥狀開(kāi)始明顯好轉(zhuǎn)。

3.2 小鼠血清炎癥因子水平比較

與空白對(duì)照組比較，模型組的小鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，白花蛇舌草水提組、醇提組小鼠血清炎癥因子IL-6水平顯著高于空白組(P<0.01)，IL-1β、TNF-α水平也明顯高于空白組(P<0.05)，但各時(shí)間節(jié)點(diǎn)上述炎癥因子水平均顯著低于模型組(P<0.05)，6-12 h時(shí)間段各炎癥因子達(dá)到峰值，24 h時(shí)各炎癥因子水平顯著低于6 h時(shí)炎癥因子水平(P<0.01)，48 h后開(kāi)始趨于正常水平。見(jiàn)表1、表2、表3。

表1 各組小鼠血清IL-6水平比較

組別動(dòng)物數(shù)(n)6h12h24h48h空白對(duì)照組164.47±0.381.62±0.070.41±0.140.34±0.46模型組1613.62±0.11??11.70±1.01??2.64±1.560.65±0.14?地塞米松組1610.37±0.31??▲2.67±0.45▲1.31±0.460.58±0.98?HD水提物組1611.45±0.42??▲9.51±1.81??1.48±0.32?0.62±0.18?HD醇提物組1611.32±0.04??▲10.08±2.83??1.81±0.820.54±0.07?

注：與空白組比較，**P<0.01；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.01；與模型組比較，●P<0.05。下同。

表2 各組小鼠血清IL-1β水平比較

組別動(dòng)物數(shù)(n)6h12h24h48h空白對(duì)照組160.26±0.070.17±0.070.28±0.060.30±0.07模型組161.94±1.36?1.75±0.870.29±0.060.41±0.13地塞米松組160.38±0.13▲0.21±0.10▲0.26±0.030.31±0.10HD水提物組161.34±0.21?0.25±0.04▲0.28±0.010.37±0.13HD醇提物組161.25±0.27?0.24±0.04▲0.27±0.020.28±0.02

表3 各組小鼠血清TNF-α水平比較

組別動(dòng)物數(shù)(n)6h12h24h48h空白對(duì)照組160.20±0.020.11±0.000.04±0.040.16±0.07模型組160.88±0.74?0.25±0.160.10±0.03?0.08±0.02?地塞米松組160.22±0.03●0.08±0.04●0.13±0.07?0.11±0.04HD水提物組160.31±0.12●0.09±0.06●0.07±0.050.06±0.04?HD醇提物組160.34±0.12●0.11±0.020.09±0.040.08±0.03?

3.3 小鼠肝臟組織病理變化

正常組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，未見(jiàn)腫脹、變性或壞死。模型組小鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯腫脹、變性，大部分細(xì)胞邊界及細(xì)胞核模糊不清，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞脂肪樣變性，可見(jiàn)部分細(xì)胞凋亡，24 h后，病變情況逐漸減輕。白花蛇舌草提取物組和陽(yáng)性組小鼠肝損害較模型組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，少數(shù)肝細(xì)胞有輕微水腫，其余未見(jiàn)明顯異常變化。見(jiàn)圖1。

圖1各組小鼠肝組織病理變化(HE染色，×200)

4 討論

膿毒癥是創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染等臨床急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要原因。膿毒癥嚴(yán)重時(shí)，由于內(nèi)毒素刺激機(jī)體，促使炎性細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在組織中募集和活化，然后分泌一系列炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子、氧自由基及蛋白酶等，互成反饋，不斷擴(kuò)大炎性反應(yīng)，形成瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6-7]。據(jù)研究表明，病原微生物與TLR4受體結(jié)合后激活特異的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，介導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6，以及次一級(jí)炎癥介質(zhì)等的合成和釋放與膿毒癥的形成緊密相關(guān)[8]。

基于此，本研究通過(guò)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)LPS膿毒癥模型小鼠各時(shí)間節(jié)點(diǎn)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量變化，并結(jié)合肝臟病理學(xué)變化，觀察白花蛇舌草提取物對(duì)LPS膿毒癥小鼠炎癥的干預(yù)效果，探討白花蛇舌草提取物對(duì)外周血中相應(yīng)炎癥因子蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步明確白花蛇舌草的抗炎作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，白花蛇舌草水提取物和醇提取物均能夠有效改善LPS膿毒癥小鼠的肝損傷，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α水平，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制這些炎癥因子的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)的平衡，從而達(dá)到治療效果。

有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，胞外的LPS通過(guò)細(xì)胞膜上的TLR4受體激活胞內(nèi)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子最終導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。下一步本課題組擬應(yīng)用Real-time Quantitative RT-PCR方法研究TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵因子在白花蛇舌草提取物干預(yù)LPS膿毒癥模型小鼠后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝組織中的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步驗(yàn)證白花蛇舌草提取物在固有免疫方面的抗炎作用機(jī)制，明確其作用靶點(diǎn)，為白花蛇舌草在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考依據(jù)。