趙美靜 孟 強 田 雨 劉樹文，2，3* 何 玲

（1 西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院 陜西楊凌712100 2 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心 陜西楊凌712100 3 西北農(nóng)林科技大學合陽葡萄試驗示范站 陜西渭南715300 4 西北農(nóng)林科技大學園藝學院 陜西楊凌712100）

葡萄酒釀造過程中，植物乳桿菌可以適應惡劣的葡萄酒環(huán)境[1-2]，啟動二次發(fā)酵——蘋果酸乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，MLF）。與酒酒球菌相比較，植物乳桿菌不僅具有更多MLF 相關的酶類[3-4]，而且植物乳桿菌可產(chǎn)生植物乳桿菌素（pln）[5-8]，抑制或殺死某些葡萄酒中的有害乳酸菌，從而抑制葡萄酒破敗，部分替代葡萄酒中二氧化硫作用，降低二氧化硫的使用量[9-10]。目前，在酒酒球菌中沒有明確發(fā)現(xiàn)存在編碼細菌素的基因和種類，使其不具抑菌或殺菌作用。由此，植物乳桿菌具有成為葡萄酒中蘋果酸乳酸發(fā)酵劑的巨大潛能[9]。

研究表明，植物乳桿菌菌株通過與其它乳酸菌共培養(yǎng)，可誘導產(chǎn)生細菌素或提高細菌素產(chǎn)量[11-13]。如植物乳桿菌NC8[14]、J23[15]在液體培養(yǎng)基單獨培養(yǎng)不能產(chǎn)生細菌素，與某些革蘭氏陽性菌共培養(yǎng)誘導均產(chǎn)生細菌素。Maldonado 等學者[16]在植物乳桿菌NC8 菌株中最早發(fā)現(xiàn)了自誘導現(xiàn)象。最近研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌進行共培養(yǎng)誘導產(chǎn)細菌素時，不同種屬的誘導菌株其誘導能力也不同[11]。目前通過共培養(yǎng)提高植物乳桿菌細菌素產(chǎn)量的研究日益增多，而如何選擇誘導菌株作為細菌素產(chǎn)生的環(huán)境刺激因素是研究的主要方向。

細菌素的產(chǎn)生不僅需要外界環(huán)境的刺激，還需要其本身基因的調(diào)控。目前研究植物乳桿菌菌株的pln 基因座，發(fā)現(xiàn)pln 基因座非常復雜且多變[17-18]，包含5 ～6 個 操縱子，plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUV、plnMNOP 等[19]，同時也不斷發(fā)現(xiàn)新的基因[20]。很多基因的編碼蛋白功能仍未知，有待進一步研究。目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控操縱子[21]有兩種：plnABCD[22]和plnC8IF-plnC8HK-plnD[23]，而在誘導產(chǎn)生細菌素的植物乳桿菌中，很多植物乳桿菌菌株 如NC8，J23 等，調(diào) 控 操 縱 子 是plnC8IFplnC8HK-plnD。研究植物乳桿菌的pln 基因座，從而發(fā)現(xiàn)新的功能基因或發(fā)現(xiàn)基因突變或基因缺失，具有重要意義。

本試驗通過共培養(yǎng)篩選得到兩株植物乳桿菌XJ25 和PC520，分離于新疆產(chǎn)區(qū)自發(fā)進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的干紅葡萄酒和楊凌泡菜。利用全基因組測序，全面分析比較共培養(yǎng)產(chǎn)生細菌素的植物乳桿菌間基因的差異，重點關注調(diào)控操縱子之間的基因差異，探究調(diào)控植物乳桿菌細菌素表達的機制。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

植物乳桿菌XJ25，PC520 等乳酸菌均由本實驗室保藏，非乳酸菌菌株（巴氏醋桿菌、李斯特氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等）由本校食品學院惠贈。

MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖2%，吐溫-80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，醋酸鈉0.5%，檸檬酸氫二胺0.2%，七水合硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，pH 調(diào)至6.3 左右，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉5%，氯化鈉1%，調(diào)節(jié)pH 至7.0。

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%。

1.2 試劑與儀器

細菌基因組提取試劑盒，上海生物工程有限公司；DNA Marker，Taq 酶，RNaseA 等，寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化純。

Micro CL17 高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；各種規(guī)格移液器，德國Eppendorf 公司；Orion Star A111 pH 計，美國賽默飛世爾科技公司；SHP-250 生化培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器公司；ChampGel 5000 plus 凝膠成像儀，北京賽智科技有限公司；YJ300HC 電泳儀，北京君意科技有限公司；EXL800 酶標儀，美國博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌活性測定

1.3.1.1 瓊脂擴散法 （Spot-on-the-lawn）[5，24]將試驗菌株點樣于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)；指示菌株按1%（終濃度5×105cfu/mL）接種于半固體培養(yǎng)基中，傾倒覆蓋在MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.1.2 96 孔板法[15]每個孔板中加入：100 μL（2×）LB 液體培養(yǎng)基，100 μL 不同稀釋梯度的無細胞上清液，30 μL 的指示菌株 （金黃色葡萄球菌，終濃度107CFU/mL），37 ℃，靜止培養(yǎng)24 h；每3 h測定OD600。對照組不添加上清液，指示菌株正常生長。重復3 次。其中，當稀釋一定倍數(shù)的無細胞上清液可抑制50%指示菌株生長時，表示抑菌活性為1 AU。

1.3.2 共培養(yǎng)誘導[15]分別將2%過夜培養(yǎng)的植物乳桿菌（活菌數(shù)至109cfu/mL），與0.5%用于誘導的菌株（活菌數(shù)為107cfu/mL），接種至MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃誘導培養(yǎng)55 h。每3 h 取樣測OD600；同時取樣4 mL，12 000 r/min 離心15 min，獲得上清液；調(diào)節(jié)上清液pH 至7.0；0.22 μm 濾膜過濾除菌，利用96 孔板法測抑菌活性，其中對照組為單獨培養(yǎng)的植物乳桿菌及誘導菌株。在此基礎上，對共培養(yǎng)上清液進行過氧化氫酶，蛋白酶K（1 g/L）等處理，同樣測定抑菌活性。

1.3.3 共培養(yǎng)產(chǎn)細菌素植物乳桿菌基因組重測序及pln 基因座分析[12，17]按照細菌基因組提取試劑盒步驟，提取產(chǎn)細菌素菌株基因組DNA，送由北京諾禾致源生物公司，對篩選獲得產(chǎn)細菌素植物乳桿菌菌株進行全基因組重測序。此外，植物乳桿菌XJ25 和PC520 經(jīng)全基因組重測序的基因組序列已在NCBI 公開發(fā)布，GenBank 序列登錄號分別為：MAXE00000000 和MAMT00000000。

植物乳桿菌菌株的pln 基因座序列數(shù)據(jù)分析與處理：RAST Server（http：//rast.nmpdr.org/）進行pln 基因座基因注釋；在NCBI 利用Blast 比對分析基因間的差異；利用Lasergene 7.0 軟件，進行基因序列及蛋白序列分析；Easyfig2.1 軟件作圖，獲得菌株的pln 基因座遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細菌素植物乳桿菌的初篩

在固體培養(yǎng)基上，對14 株植物乳桿菌進行抑菌活性測定，從中篩選獲得了兩株抑菌譜廣，且抑菌效果較強的植物乳桿菌XJ25 和PC520。其中，12 株指示菌包括致病菌，及葡萄酒中可能存在的微生物（酒酒球菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、釀酒酵母、醋酸菌等）。由表1可知，14 株試驗菌株對釀酒酵母及單增李斯特氏菌均無抑制性；相反地，植物乳桿菌XJ25 和PC520 對其他9 株指示菌株都有較強的抑制作用。13 株植物乳桿菌 （除542外），對大腸桿菌，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌均有明顯抑制效果。由此，試驗選擇金黃色葡萄球菌作為96 孔板法測定抑菌活性的指示菌株。同時，醋酸菌是葡萄酒中的污染菌，可導致葡萄酒的“酸破敗病”，而14 株植物乳桿菌中，只有4 株菌（XJ25，PC520，215，509）對醋酸菌表現(xiàn)了較強抑菌效果。

綜上所述，14 株植物乳桿菌中，菌株XJ25 和PC520 抑菌范圍大，抑菌性較強，對醋酸菌有一定的抑制作用。

表1 Spot-on-lawn 法測得植物乳桿菌菌株XJ25 和PC520 抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of L.plantarum XJ25 and PC520 by the “spot-on-the-lawn” method

2.2 共培養(yǎng)誘導

進行共培養(yǎng)誘導時，用于誘導的菌株糞腸球菌ATCC25923 不能使植物乳桿菌XJ25 和PC520 產(chǎn)生抑菌活性，表明了誘導菌株具有一定的選擇性，不同菌株誘導能力有所不同，這與之前研究相符[12]。結(jié)果進一步表明，植物乳桿菌XJ25、PC520，誘導菌株糞腸球菌XJ26M、ATCC25923 單獨培養(yǎng)時，對指示菌株無抑制性，而與糞腸球菌XJ26M 共培養(yǎng)，成功誘導XJ25 和PC520 產(chǎn)生抑菌性。如圖1所示，植物乳桿菌XJ25 和PC520 在共培養(yǎng)生長條件下，在生長對數(shù)期（4～25 h）產(chǎn)生抑菌活性，并在10 h 后，抑菌活性高達220 AU/mL。在即將進入穩(wěn)定期前，抑菌物質(zhì)產(chǎn)量低至15 AU/mL。并且，菌株XJ26M 經(jīng)高溫滅活后，試驗菌株XJ25 和PC520 均無抑菌性，滅活菌株XJ26M 失去了誘導能力。這表明植物乳桿菌XJ25 和PC520，在外環(huán)境刺激（活的糞腸球菌XJ26M）下，才可誘導產(chǎn)生抑菌性。

圖1 植物乳桿菌XJ25，PC520 和糞腸球菌XJ26M共培養(yǎng)生長和共培養(yǎng)誘導上清液抑菌活性曲線圖Fig.1 Growth curves of L.plantarum strain XJ25 and PC520 co-cultivated with E.faecalis XJ26M and production of inducible antimicrobial activity of cell-free supernatants

共培養(yǎng)誘導上清液進一步進行蛋白酶K 等處理，失去了抑菌活性，進一步確定了抑菌活性物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)——細菌素。因此，試驗成功篩選出兩株與糞腸球菌XJ26M 共培養(yǎng)，產(chǎn)生細菌素的植物乳桿菌XJ25 和PC520。

2.3 植物乳桿菌XJ25 和PC520 的pln 基因座遺傳分析

植物乳桿菌XJ25 和PC520 的pln 基因座，分別由一段22 383 bp 和20 983 bp 核苷酸序列組成，并獲得其pln 基因座遺傳圖譜（如圖2）；同時，兩株菌pln 基因座中的orfs，與植物乳桿菌NC8[16]，J23[20]進行相似度比較及編碼蛋白功能預測（表2）。

結(jié)果表明，菌株XJ25 和PC520 的pln 基因座，均有6 個操縱子（plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUVW、plnABCD、plnMNOP、plnWXY）組成，還有一個新的未知功能的orf1；與NC8 和J23 的pln 基因座比較，XJ25 和PC520 的pln 基因座十分完整，并且兩株菌的基因座核苷酸序列較長。

操縱子plnGHSTUV 具有高度保守性；由表2可知，不同菌株間，轉(zhuǎn)運操縱子plnGHSTUV 的基因相似度高達99%～100%。由其中基因編碼蛋白功能可知，此操縱子功能與細菌素的轉(zhuǎn)運相關。菌株PC520 中plnS 基因發(fā)生了缺失，這可能影響細菌素的轉(zhuǎn)運功能。

操縱子plnEFI 和plnRLJK，是細菌素的結(jié)構(gòu)基因，編碼細菌素PlnE、PlnF、PlnJ、PlnK；其中，PlnL 和PlnI 為免疫蛋白。這兩個操縱子相對保守，但與菌株NC8 和J23 的plnF 基因進行序列比對時，發(fā)現(xiàn)試驗菌株XJ25 的plnF 基因，有兩個位點突變，從而導致編碼蛋白PlnF 分別在14 位（AS）和42 位（V-I），產(chǎn)生兩個氨基酸突變（圖3A），而之前研究并沒有發(fā)現(xiàn)plnF 基因突變，而對plnE基因研究發(fā)現(xiàn)兩個氨基酸的缺失，導致其功能的改變[25]。

由表2可知，操縱子plnMNOP，其中編碼的蛋白功能主要體現(xiàn)在免疫方面，并且相較以上的結(jié)構(gòu)基因編碼的細菌素，PlnN 蛋白無任何細菌素活性，但是，菌株XJ25 的plnM 基因與NC8 的相似度只有95%。

操縱子plnWXY 中，plnX 和plnY 分別編 碼HigB、HigA 毒性蛋白，他們在pln 基因座中的功能還未知，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株PC520 的plnY 基因發(fā)生了缺失。

圖2 植物乳桿菌XJ25 和PC520 細菌素基因座遺傳圖譜Fig.2 Genetic map of the pln loci in L.plantarum XJ25 and L.plantarum PC520

表2 植物乳桿菌XJ25 和PC520 細菌素基因座編碼蛋白及其相似度比較Table 2 Proteins encoded by pln loci of two strains and their similarity to each other’s counterparts

植物乳桿菌XJ25 和PC520，調(diào)控操縱子是三組分plnABCD（圖2），但是兩株菌的plnB 和plnC基因，相似度只有97%左右，其中分別有38 個與17 個堿基不同，說明調(diào)控子的復雜多變性。而與植物乳桿菌NC8 和J23 的調(diào)控子plnNC8IFNC8HK-D 相較，基因差異很大，導致功能發(fā)生改變[23]。plnNC8IF 基因編碼蛋白自誘導肽（AIP）與plnA 基因編碼的蛋白PlnA 誘導肽相較，其誘導能力更強。plnB 和plnNC8HK 基因，均編碼產(chǎn)生組氨酸蛋白激酶，但基因序列差異很大，這可能導致組氨酸蛋白激酶的活性的改變。而研究表明，菌株NC8 的自誘導能力與其調(diào)控子相關，特別是自誘導肽的存在，導致自誘導現(xiàn)象產(chǎn)生[16]。而試驗菌株XJ25 和PC520 不能進行自誘導，說明調(diào)控子plnABCD 與plnNC8IF-NC8HK-D 從基因差異可能導致功能的改變。

同時，在XJ25 和PC520 的pln 基因座中發(fā)現(xiàn)了1 個未知的orf1（圖3B）。其中，orf1 編碼的假設蛋白包括30 個氨基酸，其功能有待進一步研究。

圖3 細菌素PlnF 蛋白序列比對及orf1 的核苷酸序列Fig.3 The sequence alignments of bacteriocin PlnF protein and orf1 DNA sequence

在植物乳桿菌XJ25 和PC520 共培養(yǎng)過程中，糞腸球菌XJ26M 是誘導其細菌素產(chǎn)生的不可或缺的環(huán)境因素。而植物乳桿菌細菌素的產(chǎn)生不僅受外在環(huán)境刺激，更有內(nèi)在25～26 個基因的共同調(diào)控。其中，pln 基因簇控制植物乳桿菌細菌素的合成，轉(zhuǎn)運，免疫，分泌及調(diào)控等。植物乳桿菌XJ25 和PC520，基于全基因組重測序，對其進行pln 基因座遺傳比較分析發(fā)現(xiàn)6 個操縱子，與目前研究的pln 基因簇相似。多數(shù)保守基因的序列比對結(jié)果，相似度在98%～100%，其編碼的蛋白功能基本不變。并且分析表明，個別基因（plnF、plnB、plnT、plnY）發(fā)生了突變或缺失，這可能導致編碼蛋白功能的改變，從而影響植物乳桿菌細菌素的產(chǎn)生，這有待進一步研究。

同樣地，植物乳桿菌NC8 和J23 也只能通過共培養(yǎng)誘導產(chǎn)生細菌素。與試驗菌株進行pln 基因座分析比較，發(fā)現(xiàn)pln 基因間的差異非常大。植物乳桿菌NC8 和J23 的pln 基因座中，調(diào)節(jié)操縱子是三組分plnNC8IF-NC8HK-D，可編碼產(chǎn)生自誘導肽，菌株XJ25 和PC520 也可誘導其產(chǎn)生細菌素，調(diào)控子是plnABCD，不能產(chǎn)生子誘導肽。因此，共培養(yǎng)條件下誘導產(chǎn)生細菌素，由兩種不同的調(diào)控操縱子發(fā)揮作用，這與Maldonado 等人[12]的研究相符。

3 結(jié)論

植物乳桿菌中，共培養(yǎng)現(xiàn)象是普遍存在的。植物乳桿菌XJ25 和PC520，通過與活菌糞腸球菌XJ26M 共培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生細菌素。而植物乳桿菌素的產(chǎn)生受多個基因的共同調(diào)控，其中植物乳桿菌XJ25 和PC520 的pln 基因座，均有6 個操縱子組成；但個別基因（plnF、plnY、plnT）發(fā)生了突變或缺失，這可能導致其編碼蛋白功能的改變或喪失，最終可能影響植物乳桿菌細菌素表達。植物乳桿菌的pln 基因座雖然相似，但仍有新的orf 出現(xiàn)，功能也有待進一步研究。