韓煥美 張愛(ài)霞 鄭新華 陳 晞 何桂華

（濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東濟(jì)南 250014）

1 前言

迷迭香提取物（Rosemary Extract）含有鼠尾草酸、迷迭香酚、迷迭香酸、熊果酸、鼠尾草酚、表迷迭香酚、異迷迭香酚、迷迭香二酚等多種有效成分，可分為油溶性（抗氧化劑）和水溶性（抗氧化劑及防腐劑）2種，前者有效成分主要為鼠尾草酸，后者主要為迷迭香酚[1]。迷迭香提取物天然無(wú)毒，抗氧化功效遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的維生素C、維生素E、茶多酚等天然抗氧化劑，是人工合成抗氧化劑 BHA、BHT 的 2～4 倍，且其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易分解，可耐190～240℃高溫，徹底克服了維生素C、茶多酚等大多數(shù)天然抗氧化劑遇高溫分解這一致命弱點(diǎn)[2]。故相比其他同類(lèi)產(chǎn)品，它具有更高效廣譜的優(yōu)勢(shì)。研究者發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物在300 mg/kg 時(shí)，其抗氧化活性相當(dāng)于200 mg/kg BHA，大于 100 mg/kg 維生素 E[3，4]。迷迭香提取物和茶多酚提取物在食用油脂中的應(yīng)用前景廣泛，但檢測(cè)方法還不成熟，本文旨在建立其相應(yīng)的檢測(cè)方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑材料與儀器設(shè)備

乙腈，色譜純，默克化工技術(shù)有限公司；冰乙酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鼠尾草酸高純?cè)噭?，純度?5%； 鼠尾草酚高純?cè)噭?，純度?8%；熊果酸高純?cè)噭?，純度?8%；迷迭香酸高純?cè)噭?，純度?7%，均購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司； 水，Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備；Agilent1260 series液相色譜儀，配有FLD 和DAD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；分析天平（感量為0.1 mg），梅特勒-托利多公司；Milli-Q 純水器，美國(guó) Millipore 公司；IKA-KS130型振蕩器，德國(guó) IK 公司； 色譜柱，Waters XTerra RP-C18（250×4.6 mm，5 μm）。油樣橄欖油、大豆油、花生油等，均購(gòu)于超市。

2.2 對(duì)照品溶液配制

熊果酸對(duì)照品溶液：稱(chēng)取熊果酸粉劑0.102 g，加入甲醇+水（1+1，V/V）約 2 mL，然后加入約 0.5 mL氫氧化鈉（20 g/L）溶液，攪拌、震蕩使其完全溶解，然后用甲醇+水（1+1，V/V）定容至 10 mL，濃度為1 mg/mL[5]；迷迭香酸對(duì)照品溶液：稱(chēng)取粉劑0.2577 g，置 50 mL 容量瓶中,加乙腈、甲醇+乙酸（9+1，V/V）適量使其溶解,再加乙腈稀釋至50 mL,搖勻，濃度為5.0 mg/mL；鼠尾草酸對(duì)照品溶液：稱(chēng)取鼠尾草酸粉劑0.0105 g，置10 mL 容量瓶中,加乙腈、甲醇+乙酸（9+1，V/V）適量使其溶解,再加乙腈稀釋至10 mL,搖勻，濃度為1.0 mg/mL；鼠尾草酚對(duì)照品溶液：稱(chēng)取鼠尾草酚粉劑0.0202 g，置10 mL 容量瓶中,加乙腈、甲醇+乙酸(9+1，V/V)適量使其溶解,再加乙腈稀釋至10 mL,搖勻，濃度為2.0 mg/mL[6]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的建立

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精確移取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻。制成質(zhì)量濃度均分別為 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。在設(shè)定色譜條件下,分別取10 μL進(jìn)行HPLC 分析。以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.4 液相色譜分離條件

流動(dòng)相：A，乙腈；B，H2O（含體積分?jǐn)?shù) 4%的冰乙酸）；梯度洗脫見(jiàn)表1；流速: 0.8 mL/min；柱溫: 40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm、280 nm；進(jìn)樣體積：10 μl。

表1 HPLC梯度洗脫條件

2.5 油脂前處理及測(cè)定

精密稱(chēng)取樣品約2.000 g，加入10 mL 正己烷溶解，然后用10 mL 飽和正己烷的乙腈萃取，振蕩，超聲25 min，離心后取乙腈層，定容至 10 mL，過(guò) 0.45 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 4種迷迭香提取物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性

按照2.3 的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，4種迷迭香提取物對(duì)照樣品的液相色譜圖見(jiàn)圖1?？瞻讟颖局屑尤胍阎獫舛然旌蠈?duì)照品溶液，稀釋至最低出峰濃度，取信噪比（S/N）=3（S、N 分別為信號(hào)和噪聲的有效功率）時(shí)作為方法的定性檢出限濃度，信噪比（S/N）=10 時(shí)作為方法的定量檢出限濃度。然后根據(jù)加入空白樣本質(zhì)量、定容體積、檢出限濃度計(jì)算出該方法的檢出限，見(jiàn)表2。

圖1 迷迭香提取物標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜圖

表2 4種迷迭香提取物對(duì)照品的線(xiàn)性方程

3.2 4種迷迭香提取在油脂中檢測(cè)法研究

在4種提取物的分離分析過(guò)程中，影響因素很多，除色譜柱之外，流動(dòng)相及流動(dòng)梯度是關(guān)鍵。結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，初步選擇乙腈、甲醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，水、乙酸水溶液、乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相中的水相。本文比較了乙酸水溶液+甲醇、水+甲醇、乙酸銨水溶液+甲醇、乙酸水溶液+乙腈、水+乙腈等幾種流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，1%乙酸水溶液+甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，不管如何調(diào)整洗脫梯度，各化合物的吸收峰都不夠尖銳，跨度較大，不利于定量； 水溶液+甲醇、0.4%乙酸水溶液+甲醇這2類(lèi)流動(dòng)相也有類(lèi)似的問(wèn)題；2%乙酸銨水溶液+甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，鼠尾草酸保留時(shí)間小于2.5 min，而熊果酸的保留時(shí)間大于15 min，這說(shuō)明乙酸銨水溶液的極性太大，因此，可以確定，乙酸銨水溶液和甲醇不適合作為此方法的流動(dòng)相。所以，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，多以乙酸水溶液+乙腈作為該方法的流動(dòng)相。

首先選擇了1%乙酸水溶液+乙腈作為流動(dòng)相，峰型尖銳對(duì)稱(chēng)，但是鼠尾草酸的保留時(shí)間不合適；又選擇水+乙腈作為流動(dòng)相，峰型尖銳對(duì)稱(chēng)，鼠尾草酸和迷迭香酸分離度不夠。結(jié)合1%乙酸水溶液+乙腈、水+乙腈2種流動(dòng)相的優(yōu)勢(shì)，最后選擇0.4%乙酸水溶液+乙腈作為試驗(yàn)的流動(dòng)相，采取了梯度洗脫，以減少分析時(shí)間和提高分離效率，為了更好地控制各化合物的保留時(shí)間，又稍稍降低了流速，定為 0.8 mL/min。

在方法的優(yōu)化過(guò)程中，選擇多波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇了4 個(gè)，分別為210 nm、251 nm、280 nm、460 nm，同時(shí)采集210～640 nm 的光譜；流動(dòng)相和梯度洗脫條件確定后，分析各化合物的吸收光譜圖，見(jiàn)圖2。不難看出，4種化合物的 λmax（最大吸收波長(zhǎng)）各異，鼠尾草酸：λmax=216 nm；迷迭香酸：λmax=220 nm；鼠尾草酚：λmax=231 nm；熊果酸：λmax=210 nm。但是鼠尾草酸、迷迭香酸、鼠尾草酚的光譜圖顯示其在260～360 nm 有完整的吸收峰。多波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)能選擇各個(gè)化合物的最佳吸收波長(zhǎng)，能有效提高目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度[7]，但是，其定性定量譜圖則顯得比較凌亂，經(jīng)過(guò)綜合考慮選擇280 nm 作為3種化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm 則為熊果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。由圖1和圖2可知，各形態(tài)完全基線(xiàn)分離，峰型對(duì)稱(chēng)、尖銳，滿(mǎn)足檢測(cè)需要，但是鼠尾草酸和迷迭香酸的分離仍需進(jìn)一步調(diào)整色譜條件。

圖2 4種迷迭香提取物對(duì)照品的液相色譜圖和光譜圖

3.3 4種迷迭香提取在油脂中提取方法研究

4種迷迭香提取物均為極性相對(duì)較強(qiáng)的化合物，含有脂溶性物質(zhì)，因此在提取液的選擇上以甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑作為提取溶液。超聲波可產(chǎn)生高速?gòu)?qiáng)力的物理作用，能提高溶解效率。超聲萃取具有耗時(shí)短、樣品無(wú)交叉污染的特點(diǎn)，適合大批量樣品的測(cè)定[8]。因此，依據(jù)文獻(xiàn)及化合物本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析，本著簡(jiǎn)單便捷、減少交叉污染的原則，選擇了有機(jī)溶劑-超聲提取方式，提取溶劑則選擇了與流動(dòng)相較為一致的試劑。

首先固定超聲時(shí)間15 min，選擇最優(yōu)的提取溶劑。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 油脂樣本，加入10 mL 正己烷溶解，然后用10 mL 甲醇萃取2 次，合并萃取液，氮吹濃縮，然后用甲醇定容至10 mL，然后過(guò)濾膜上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4種化合物的回收率都不高，為59.4%～77.3%。采用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)乙醇溶液作為提取溶劑，回收率為66.7%～75.6%； 乙腈溶液作為提取溶劑，回收率為76.1%～88.6%； 乙酸乙酯作為提取溶劑，回收率為71.2%～80.6%?？梢?jiàn)，乙腈作為提取溶劑有利于更好地提取油脂中的目標(biāo)產(chǎn)物，因此，先將正己烷和乙腈按照體積分?jǐn)?shù)1∶5 的比例混溶，待靜止后分層，可得到飽和正己烷的乙腈溶液，然后按照上述方法提取油脂中的目標(biāo)產(chǎn)物，回收率為72.4%～90.6%，滿(mǎn)足檢測(cè)需求。為了提高提取效率和簡(jiǎn)化提取步驟，采用飽和正己烷的乙腈提取時(shí)，適當(dāng)增加混勻次數(shù)，萃取液定容至10 mL，然后在過(guò)濾膜上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)回收率為70.4%～89.9%，并沒(méi)有顯著下降，因此，提取溶劑最終選擇飽和正己烷的乙腈溶液。

在減少萃取次數(shù)的前提下，增加震蕩時(shí)間使得加標(biāo)回收率并沒(méi)有明顯降低，因此，又優(yōu)化了超聲時(shí)間。不同超聲時(shí)間下，4種化合物的加標(biāo)回收趨勢(shì)見(jiàn)圖3。從圖3明顯看出，雖然個(gè)別化合物回收率在不同的時(shí)間段有顯著差異，但是，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率逐漸升高，25 min 或 30 min 以后，變化甚微，因此，最終選擇超聲時(shí)間為25 min。

圖3 4種迷迭香提取物對(duì)照品的加標(biāo)回收和超聲時(shí)間關(guān)系

實(shí)驗(yàn)表明，“樣品經(jīng)正己烷溶解，然后用飽和正己烷的乙腈溶液萃取，振蕩，超聲25 min，離心后取乙腈層，定容，過(guò)0.45 μm 濾膜后上機(jī)檢測(cè)”，該過(guò)程簡(jiǎn)單便捷，交叉污染小，提取效率高，加標(biāo)回收色譜圖見(jiàn)圖4。圖4中，sam、add 分別為空白樣本、加標(biāo)樣本 2 μg/mL。從圖4上不難看出：4種化合物分離度良好，回收率不是特別良好，計(jì)算回收率均為80.6%～91.3%，這可能與提取溶劑的選擇有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。

圖4 橄欖油中添加4種迷迭香提取物標(biāo)準(zhǔn)樣品/對(duì)照品的加標(biāo)回收液相色譜圖

為了驗(yàn)證該方法在檢測(cè)植物油中4種迷迭香提取物的通用性，實(shí)驗(yàn)室選擇了橄欖油、大豆油、花生油、調(diào)和油等4種植物油脂。每種油脂準(zhǔn)確稱(chēng)取約2.0 g 樣本 12份，每 6份為一組，分別添加 1.0 μg/mL和2.0 μg/mL 的4種對(duì)照品，然后按照上述提取過(guò)程提取后上機(jī)檢測(cè)，依據(jù)線(xiàn)性方程可得對(duì)應(yīng)化合物的濃度，最后計(jì)算可得回收率，見(jiàn)表3。

表3 迷迭香提取物對(duì)照品加標(biāo)濃度和回收率

（續(xù)表3）

4 結(jié)語(yǔ)

抗氧化劑的添加有利于降低油脂的過(guò)氧化值，抑制油脂的氧化。但是，各類(lèi)抗氧化劑的保鮮效果與添加量有直接關(guān)系。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和文章研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物在高溫和低溫條件下均表現(xiàn)出顯著的抗氧化性，有良好的生物安全性[9-11]，可以說(shuō),迷迭香提取物是最佳的油脂類(lèi)抗氧化劑。

GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定,迷迭香提取物在食用植物油中添加限量是0.7 g/kg。本文通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、提取溶劑和提取時(shí)間等，最終建立了4種迷迭香提取物的檢測(cè)方法，能有效地檢測(cè)食用植物油添加的4種迷迭香提取物，經(jīng)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其分離度好，對(duì)照品吸收峰型尖銳對(duì)稱(chēng)，4種油脂中加標(biāo)回收率為80.6%～91.3%。