丁秀瓊 黃 武 劉建芳 林锏銳 鄭俏慧 楊 勁 劉 驍

（1.湛江海關(guān)技術(shù)中心 廣東湛江 524000；2.中國檢驗認(rèn)證集團(tuán)廣東有限公司湛江分公司）

1 前言

實驗室能力驗證是指利用實驗室間指定檢測數(shù)據(jù)的比對，確定實驗室從事特定測試活動的檢測能力[1]。中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）將能力驗證作為評價實驗室技術(shù)能力的重要方法之一，與現(xiàn)場評審構(gòu)成了互為補充的兩種能力評價技術(shù)[2]。實驗室則將能力驗證用作有效的外部質(zhì)量控制方法，并將其作為內(nèi)部質(zhì)量控制的補充，持續(xù)監(jiān)控實驗室檢測能力。2018年，本實驗室參加由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心（ACAS）組織實施的礦泉水中微生物檢測能力驗證，取得了滿意的結(jié)果?，F(xiàn)對本次能力驗證活動進(jìn)行總結(jié)分析，以持續(xù)提升實驗室檢測能力。

2 材料與方法

2.1 樣品

本次礦泉水微生物能力驗證包含4 個項目，每個項目2 個樣品。真空西林瓶內(nèi)裝白色凍干物，復(fù)原后即為人工污染的礦泉水樣品。由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供，項目名稱、項目代碼及對應(yīng)樣品標(biāo)識分別為大腸菌群ACAS-PT550：18-R848、18-J093； 銅綠假單胞菌 ACAS-PT551：18-N468、18-U473； 糞鏈球菌 ACAS-PT552：18-J636、18-K197； 產(chǎn)氣莢膜梭菌 ACAS-PT553：18-H425、18-S133。

2.2 儀器與試劑

HFsafe-1500 LC 型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；GHP-9160 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GR110DR 型立式高壓蒸汽滅菌器（美國ZEALWAY）；VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）；DM4B 型leica 數(shù)字顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司廣州分公司）；微生物過濾系統(tǒng)（美國密理博）；ZF-1B 型紫外分析儀（上海汗諾儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（瑞士Salvislab）；智能氣體工作站Anoxomat MARKⅡ（荷蘭MART 公司）。乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（批號：160829）；亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液（BGLB）（批號：170830）；KF 鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基（批號：171008）； 腦心浸萃液體培養(yǎng)基（批號：180412）；腦心浸萃瓊脂培養(yǎng)基（180412）；假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN 瓊脂（批號：180512）；金氏 B 培養(yǎng)基（批號：170921）；亞硫酸鹽-多黏菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）（批號：160512）；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）（批號：180105）；動力-硝酸鹽培養(yǎng)基（180504）；含鐵牛奶培養(yǎng)基（批號：180612）； 卵黃瓊脂培養(yǎng)基（批號：180409）；乙酰胺肉湯（批號：180413）；鈉氏試劑（批號：180510）；3%過氧化氫酶試劑（批號：180710）；膽汁肉湯（批號：180727）；美國密理博，直徑 47 mm，孔徑 0.45 μm 濾膜（批號：F4BA80390）；杭州吉沃，直徑 47 mm，孔徑 0.45 μm（批號：20180702）、0.22 μm 濾膜（批號：20180608）；VITEK 2 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（GN）（批號：2410252413）；VITEK 2 革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡（GP）（批號：2420689403）；VITEK 2 革蘭氏厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡（ANC）（批號：244069920）。VITEK 2 細(xì)菌鑒定卡由法國生物梅里埃提供，其余試劑均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

2.3 方法

按照ACAS 《礦泉水中微生物檢測能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書》進(jìn)行樣品處理，按GB 8538—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》[3]55～58條款進(jìn)行樣品檢測，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定，綜合以上試驗結(jié)果出具報告。同時以糞腸球菌ATCC19433、大腸埃希氏菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、熒光假單胞菌ATCC49642、產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949作為對照菌進(jìn)行陽性和陰性對照試驗。試驗全過程按照GB 19489—2008《實驗室生物安全通則要求》[4]在生物安全柜中無菌操作進(jìn)行。

2.3.1 樣品水化

待樣品恢復(fù)至室溫后，開啟樣品（西林瓶包裝），立即加入20 mL 無菌水進(jìn)行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再反復(fù)用余下的無菌水清洗西林瓶內(nèi)壁（共520 mL 無菌水），回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，等同于520 mL 的待測礦泉水樣品。

2.3.2 大腸菌群多管發(fā)酵法檢測

（1）推測性檢驗：以無菌操作取10 mL 水樣，加入10 mL 雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中；取1 mL 水樣，加入10 mL 單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中； 取1 mL 水樣，加入9 mL 無菌生理鹽水中，混勻，吸取此稀釋水樣1 mL，加入10 mL 單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中；繼續(xù)稀釋水樣并接種到單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中，共接種5 個稀釋梯度，每個梯度接種5份，36℃培養(yǎng)25 h，觀察每管是否產(chǎn)氣。若有氣體產(chǎn)生，該管則為推測性檢驗陽性，需進(jìn)行確證性試驗；若不產(chǎn)氣則為陰性。

（2）確證性試驗：自推測性檢驗陽性管中取一管培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接BGLB 管，36℃培養(yǎng)48 h，觀察有無氣體產(chǎn)生。若有氣體產(chǎn)生，則為大腸菌群陽性；若無氣體產(chǎn)生，則為大腸菌群陰性。記下BGLB 陽性管數(shù)及對應(yīng)稀釋梯度，查最可能數(shù)（MPN）表，得出水樣中大腸菌群的MPN 值。

2.3.3 糞鏈球菌檢測

（1）推測性檢驗：用0.45 μm 的濾膜分別過濾10 mL、25 mL、50 mL、100 mL、250 mL 待測樣液原液，每個接種量都先加到一定量的無菌水中，使其最終體積為250 mL，然后過濾，以無菌操作方法將濾膜貼于KF 鏈球菌瓊脂平板表面，倒置，36℃培養(yǎng)48 h；觀察平板菌落形態(tài)，挑取5 個以上可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。根據(jù)菌落特征符合情況計數(shù)所取水樣中的典型菌落數(shù)。用無菌生理鹽水清洗杯壁并過濾，同時用自制加標(biāo)水樣做對照。

（2）確證性試驗：從平板上挑取5 個以上可疑菌落接種到腦心浸萃瓊脂培養(yǎng)基斜面，36℃培養(yǎng)24～48 h，挑取所生長菌落進(jìn)行氧化氫酶試驗、45℃生長試驗及膽汁肉湯試驗。同時采用VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定可疑菌落。綜合以上結(jié)果計算每250 mL 水樣中的糞鏈球菌數(shù)。

2.3.4 銅綠假單胞菌檢測

（1）推測性檢驗：采用 0.45 μm 的濾膜分別過濾10 mL、25 mL、50 mL、100 mL 及 250 mL 待測樣液原液，每個接種量都先加到一定量的無菌水中，使其最終體積為250 mL，然后過濾，以無菌操作方法將濾膜貼于CN 瓊脂選擇性培養(yǎng)基上，放于36℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)并計數(shù)。用無菌生理鹽水清洗杯壁并過濾，同時用自制加標(biāo)水樣做對照。分別計數(shù)以下3類CN 瓊脂上生長的菌落：顯藍(lán)色或綠色的疑似菌落（A）、產(chǎn)熒光的非藍(lán)/綠膿色菌落（B）、紅褐色菌落（C）。

（2）確證性檢驗：A類菌落進(jìn)行綠膿菌素確證性試驗；B類菌落進(jìn)行乙酰胺肉湯確證性試驗；C類菌落進(jìn)行氧化酶測試、乙酰胺肉湯、金氏B 培養(yǎng)基確證性試驗。同時，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定可疑菌落。根據(jù)確證性試驗確證結(jié)果計算250 mL 水樣中銅綠假單胞菌數(shù)。

2.3.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測

（1）推測性檢驗：用孔徑 0.22 μm 的濾膜分別過濾 10 mL、25 mL、50 mL 待測樣液原液，每個接種量都先加到一定量的無菌水中，使其最終體積為50 mL，然后過濾，以無菌操作方法將濾膜貼于SPS 瓊脂選擇性培養(yǎng)基上，置于36℃厭氧培養(yǎng)24 h，計數(shù)黑色菌落。用無菌生理鹽水清洗杯壁并過濾，同時用自制加標(biāo)水樣做對照。

（2）確證性檢驗：挑取5 個黑色菌落接種到FT培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18～24 h，對培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢等確證性試驗。同時采用VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定黑色可疑菌落。綜合以上結(jié)果計數(shù)并計算每50 mL 水中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 大腸菌群

實驗室采用多管發(fā)酵法檢測礦泉水中的大腸菌群，每個樣品接種 10 mL、1 mL、0.1 mL、0.01 mL、0.001 mL 5 個稀釋梯度，結(jié)果見表1。報送結(jié)果時參照GB 4789.39—2013 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 糞大腸菌群計數(shù)》 附錄B 確定最適稀釋度，樣品18-R848 大腸菌群檢測結(jié)果為2400MPN/100mL，統(tǒng)計量（Z）=-1.1；樣品 18-J093 大腸菌群檢測結(jié)果為 1 300 MPN/100 mL，Z=1.3。兩樣品結(jié)果滿意。

表1 大腸菌群檢測結(jié)果

3.2 糞鏈球菌

參照能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書稀釋倍數(shù)不超過100 倍原則，選取過濾 10 mL、25 mL、50 mL、100 mL 及 250 mL 5 個水樣量過濾，結(jié)果見表2。該項目樣品目標(biāo)菌純度較高，KF 鏈球菌平板上呈現(xiàn)典型的紅色圓形菌落，革蘭染色為陽性球菌，過氧化氫酶陽性，45℃生長試驗陽性，膽汁肉湯試驗生長陽性，VITEK 2 革蘭氏陽性鑒定卡鑒定為98%糞鏈球菌。菌落形態(tài)及生化反應(yīng)結(jié)果同陽性對照菌株一致。選取菌落數(shù)在20～100 CFU 的濾膜計數(shù)，最終結(jié)果報告為樣品18-樣品 18-結(jié)果滿意。

表2 糞鏈球菌檢測結(jié)果

3.3 銅綠假單胞菌

選取 10 mL、25 mL、50 mL、100 mL 及 250 mL 5 個水樣量過濾，結(jié)果見表3。銅綠假單胞菌2 個樣品中，樣品N468 雜菌較多，10 mL 水樣量平板勉強能計數(shù)，CN 瓊脂平板上目標(biāo)菌為透明非綠色產(chǎn)熒光菌落，雜菌為黃色菌落，產(chǎn)熒光菌落乙酰胺肉湯試驗陽性；樣品U473 雜菌也添加了雜菌，目標(biāo)菌在CN瓊脂平板上為綠色菌落，直接計數(shù)。菌落形態(tài)及生化反應(yīng)結(jié)果同陽性對照菌株一致。目標(biāo)菌落用VITEK 2 革蘭氏陰性鑒定卡鑒定為99%銅綠假單胞菌，黃色雜菌鑒定為91%淺黃假單胞菌。最終結(jié)果報告為樣品 18-N468：400 CFU/250 mL，Z=-1.5，樣品 18-U473：680 CFU/250 mL，Z=-1.7，結(jié)果滿意。

表3 銅綠假單胞菌檢測結(jié)果

3.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌樣品也添加了雜菌，試驗過程中貼濾膜后未在濾膜上再傾注一層SPS 瓊脂培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)后菌落黑色并不明顯，SPS 瓊脂平板上呈灰色，與雜菌色差不明顯，革蘭氏染色為革蘭氏陽性粗大桿菌，動力試驗陰性，生化反應(yīng)結(jié)果同陽性對照菌株一致。VITEK 2 革蘭氏厭氧菌鑒定卡鑒定為97%產(chǎn)氣莢膜梭菌，結(jié)果如表4所示。綜合以上結(jié)果可知，報告樣品 18-S133：140 CFU/50 mL，Z=-0.1，2.0；樣品 18-H425：37 CFU/250 mL，Z=-0.3，結(jié)果滿意。

表4 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測結(jié)果

4 討論

礦泉水中微生物檢測能力驗證（ACAS-PT550/551/552/553）技術(shù)報告可以看出結(jié)果滿意率與試驗設(shè)計難度一致。ACAS-PT550 礦泉水中大腸菌群檢測有29 家實驗室參加，28 家實驗室結(jié)果滿意，結(jié)果滿意率96.6%，1 家實驗室結(jié)果可疑；試驗設(shè)計添加菌株為蠟樣芽孢桿菌（DM423）、大腸埃希氏菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、肺炎克雷伯菌(ATCC 10031)、陰溝腸桿菌(ATCC13047)、糞鏈球菌(ATCC29 212)，其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌為大腸菌群類細(xì)菌；兩組樣品添加菌株相同，添加數(shù)量不同，一組指定值為4900 MPN/100mL，另一組樣品指定值為700 MPN/100 mL。實驗室檢測過程中產(chǎn)氣情況易于觀察，只需多做2～3 個稀釋度，查表時再確定最適稀釋度，檢測難度不大，重點注意樣品水化及稀釋過程。ACAS-PT551 礦泉水中銅綠假單胞菌檢測有56 家實驗室參加，46 家實驗室結(jié)果滿意，8 家實驗室結(jié)果不滿意，2 家實驗室結(jié)果可疑，滿意率82.1%；該組樣品設(shè)置了Ⅰ～Ⅲ3 個不同數(shù)量組，其中，第Ⅰ組指定值為1 400 CFU/250 mL、第Ⅱ組指定值為3400 CFU/250 mL、第Ⅲ組為陰性樣品，需要實驗室給出 0 CFU/250 mL 或者＜1 CFU/250 mL 結(jié)果； 第Ⅰ組和第Ⅱ組樣品添加菌株相同，添加數(shù)量不同，所添加蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌種類與大腸菌群項目相同，添加銅綠假單胞菌為ATCC9027； 第Ⅲ組樣品添加弗氏檸檬酸桿菌（ATCC8090）替代銅綠假單胞菌。本實驗室在檢測過程中發(fā)現(xiàn)第Ⅱ組不但目標(biāo)菌添加濃度高，也添加了較多的雜菌，加大了目標(biāo)菌的計數(shù)難度。ACASPT552 礦泉水中糞鏈球菌檢測有20 家實驗室參加，18 家實驗室結(jié)果滿意，2 家實驗室結(jié)果不滿意，滿意率90.0%； 試驗設(shè)計添加菌株為蠟樣芽孢桿菌（DM423）、大腸埃希氏菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、肺炎克雷伯菌(ATCC10031)、弗氏檸檬酸桿菌（ATCC8090）、糞鏈球菌(ATCC29212)，兩組樣品添加菌株相同，添加數(shù)量不同，一組指定值為1 770 CFU/250 mL，另一組為 750 CFU/250 mL。糞鏈球菌樣品目標(biāo)菌純度高，添加濃度適中，平板選擇性強，生長目標(biāo)菌落顏色鮮明易于觀察計數(shù)，檢測較為容易。ACAS-PT553 礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測有26 家實驗室參加，18 家實驗室結(jié)果滿意，7 家實驗室結(jié)果不滿意，1 家實驗室結(jié)果可疑，滿意率為69.2%；試驗設(shè)計添加菌株為蠟樣芽孢桿菌（DM423）、大腸埃希氏菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、陰溝腸桿菌(ATCC13047)、產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC13124），兩組樣品添加菌株相同，添加數(shù)量不同，一組指定值為48 CFU/50 mL，另一組為153 CFU/50 mL。產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于厭氧菌，除了雜菌（蠟樣芽孢桿菌兼性厭氧）干擾外，對實驗室的厭氧設(shè)備有較高要求，否則無法形成黑色菌落，導(dǎo)致漏檢。

本輪能力驗證4 個項目均為定量項目，但除了大腸菌群不需要生化鑒定，其他3 個項目的計數(shù)均建立在對目標(biāo)菌的鑒定確證基礎(chǔ)上，是定量檢測和定性檢驗綜合能力測試。本實驗室結(jié)果均為滿意，但仍有值得注意的地方：（1）盡可能將所有樣品全部使用，并多設(shè)計幾個稀釋梯度，以找到適宜計數(shù)范圍內(nèi)的平板，尤其是添加了高濃度雜菌的樣品。（2）樣品稀釋方法有很多種，如傳統(tǒng)的1 mL 加到9 mL 的10 倍梯度稀釋，也有50 mL 加到200 mL 的倍比稀釋，也可以只計接種量而對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專瑹o論哪種稀釋方法都需要混合均勻且盡量減少樣品的損失。（3）平板培養(yǎng)后一定要及時觀察，最好每天計數(shù)1 次，防止菌落蔓延遮掩整個平板，導(dǎo)致無法計數(shù)。如果有條件的實驗室可以采用微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計數(shù)系統(tǒng)，提高計數(shù)的準(zhǔn)確度。（4）濾膜法可以檢測體積較大的水樣，但不適合檢測渾濁度高及非目標(biāo)菌密度大的水樣。本次能力驗證中銅綠假單胞菌樣品就屬于非目標(biāo)菌密度大的水樣，過濾后導(dǎo)致濾膜上非目標(biāo)菌密集，遮蓋目標(biāo)菌，影響計數(shù)，可用酶底物法[5]進(jìn)行輔助檢驗。而對于產(chǎn)氣莢膜梭菌一類厭氧菌，最好在貼好的濾膜表面再傾注一層SDS 瓊脂培養(yǎng)基[6,7]，或?qū)V膜反貼于SDS 培養(yǎng)基上，以確保厭氧條件，形成典型黑色菌落，防止漏檢。還可以參照使用夏威夷衛(wèi)生部門的雙套管法檢測[8]。（5）對目標(biāo)菌的檢驗除采用傳統(tǒng)鑒定方法，還可以借助顯色培養(yǎng)基[9]、酶聯(lián)免疫法[10]、PCR 法[11，12]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）法[13]、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)[14]、全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)[15]、基質(zhì)輔助激光解吸附電力飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）法[16]等方法進(jìn)行輔助檢驗鑒定。（6）試驗過程中按要求設(shè)置對照，出現(xiàn)問題方便查找原因；同時參照海洋水質(zhì)檢驗方法[17]及相關(guān)文獻(xiàn)[18]設(shè)置平行對照。

能力驗證是判斷和監(jiān)控實驗室能力的有效手段之一，是實驗室質(zhì)量管理和檢測技術(shù)的綜合體現(xiàn)。實驗室應(yīng)該積極參與、認(rèn)真對待每次能力驗證，并對能力驗證結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，不斷提升自身管理能力和技術(shù)水平。