馬麗媛,李 超，王偉偉

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東青島 266003;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東青島 266003；3.臨沂市中心醫(yī)院產(chǎn)科，山東臨沂 276400)

妊娠期糖尿病(GDM)是孕婦妊娠期常見(jiàn)代謝異常疾病，我國(guó)GDM患病率為3%～8%，高于同期國(guó)際水平[1]。GDM多發(fā)生于妊娠中后期，患者不僅妊娠期高血壓、子癇前期、遠(yuǎn)期糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)升高，且易出現(xiàn)早產(chǎn)、巨大兒、新生兒呼吸窘迫癥等新生兒疾病[2]，嚴(yán)重威脅母嬰健康。GDM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥應(yīng)答、代謝紊亂及免疫異常等機(jī)體內(nèi)系統(tǒng)失衡，由于GDM與2型糖尿病具有遺傳相似性，故遺傳易感性也被認(rèn)為是GDM發(fā)病的關(guān)鍵因素之一，并且得到諸多研究證實(shí)[3]。雌激素通過(guò)雌激素受體(ER)發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，可在妊娠中晚期對(duì)抗孕激素作用，從而降低脂肪、肌肉組織胰島素敏感性，導(dǎo)致GDM發(fā)生[4]。本研究通過(guò)對(duì)雌激素受體β(ERβ)基因AluI、RsaI酶切位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行分析，探討ERβ基因與GDM遺傳易感性關(guān)系，以期為GDM早期預(yù)防、干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇青島大學(xué)附屬醫(yī)院(下稱本院)2017年1-12月首診GDM患者115例作為GDM組，GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)：孕婦空腹血糖≥5.1 mmol/L，口服75 g葡萄糖1 h≥10.0 mmol/L、2 h≥8.5 mmol/L，3項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果滿足其中1項(xiàng)或以上則診斷為GDM[5]。平均(31.2±4.7)歲，平均孕周(38.3±1.2)周，產(chǎn)前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.7±3.1)kg/m2。另配對(duì)選取同期本院健康孕婦115例作為健康對(duì)照組，平均(31.9±4.2)歲，平均孕周(38.6±1.1)周，BMI(24.3±2.8)kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有吸煙史、飲酒史；(2)孕前患有高血壓、2型糖尿病，或甲狀腺功能亢進(jìn)或減退等疾病；(3)輔助生殖技術(shù)受孕；(4)孕前3個(gè)月內(nèi)或孕期使用皮質(zhì)類固醇類藥物史。兩組孕婦均為漢族人群，在年齡、孕周等一般資料比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究醫(yī)院倫理委員會(huì)支持，所有入組者均知曉本研究目的、過(guò)程及意義，簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 孕婦空腹12 h于次日清晨取乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管、肝素抗凝管靜脈血各5 mL，肝素抗凝血3 500 r/min離心5 min后用于空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)測(cè)定，EDTA-K2抗凝于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2生化指標(biāo)測(cè)定 FBG于本院檢驗(yàn)科采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，F(xiàn)IN采用羅氏Cobas E602全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定，均購(gòu)買(mǎi)成品試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室濕度、溫度均符合檢測(cè)要求。穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估(HOMA-IR)指數(shù)=空腹血糖×空腹血胰島素/22.5。

1.2.3待測(cè)基因位點(diǎn)PCR擴(kuò)增 采用北京天根生化科技公司提供的全血DNA提取試劑盒進(jìn)行總DNA提取，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分光光度儀260/280吸光度值在1.6～2.0之間為合格DNA標(biāo)本。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，參考相關(guān)文獻(xiàn)序列如下[5]：RsaI上游5′-TCT TGC TTT CCC CAG GCT TT-3′，下游5′-ACC TGT CCA GAA CAA GAT CT-3′，AluI上游5′-GAC CTG CTG CTG GAG ATG CT-3′，下游5′-AAT GAG GGA CCA CAG CA-3′。以提取DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：DNA 1.0 μL(0.15 μg/μL)、上游及下游引物各5.0 μL、10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL(10 mmoL/L)、Taq-DNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL)，余以雙蒸水補(bǔ)足25 μL。循環(huán)參數(shù)設(shè)置：94 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃ 30 s，62 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物于-4 ℃保存。

1.2.4RFLP分析 取PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物10 μL、限制性內(nèi)切酶各緩沖液1 μL在37 ℃水浴箱內(nèi)酶切3 h。終止反應(yīng)后以2%瓊脂糖凝膠電泳分離30 min，溴化乙錠染色(0.5 μg/mL)，將酶切凝膠置于紫外凝膠成像儀成像判斷基因型。RsaI酶切區(qū)分RR 基因型(片段長(zhǎng)度為125、31 bp)、rr基因型(片段長(zhǎng)度為156 bp)、Rr基因型(片段長(zhǎng)度為156、125、31 bp)，AluI酶切區(qū)分AA基因型(片段長(zhǎng)度為240、67 bp)、aa基因型(片段長(zhǎng)度為307 bp)、Aa基因型(片段長(zhǎng)度為307、240、67 bp)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；采用擬合優(yōu)度皮爾森χ2檢驗(yàn)對(duì)GDM組、對(duì)照組AluI、RsaI基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡進(jìn)行檢測(cè)；非條件Logistic回歸分析基因多態(tài)性與GDM易感性關(guān)系，以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)進(jìn)行描述風(fēng)險(xiǎn)度，并經(jīng)民族、年齡、家族史、妊娠次數(shù)等變量校正。所有檢測(cè)結(jié)果均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因型分布 GDM組與對(duì)照組AluI位點(diǎn)AA基因型、Aa基因型、aa基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，P>0.05。GDM組與對(duì)照組RsaI位點(diǎn)RR基因型、Rr基因型、rr基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，P>0.05。表明本研究選擇對(duì)象基因型具有群體代表性。

2.2AluI、RsaI位點(diǎn)基因型易感性分析 GDM組AluI位點(diǎn)AA型基因、Aa基因型比例顯著高于健康對(duì)照組，aa型基因顯著低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；基因易感性分析顯示，AA、Aa基因型孕婦會(huì)增加GDM患病相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度(OR：1.973，95%CI：1.306～2.391，P=0.012；OR：1.426，95%CI：1.112～1.685，P=0.023)，合并分析顯示A等位基因GDM患病風(fēng)險(xiǎn)高于a等位基因(OR：1.755，95%CI：1.287～2.061，P=0.019)。見(jiàn)表1。RsaI位點(diǎn)RR、Rr、rr基因型在GDM組、健康對(duì)照組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，基因易感性分析顯示該位點(diǎn)基因型與GDM患病無(wú)顯著關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 AluI位點(diǎn)基因型易感性分析[n(%)]

表2 RsaI位點(diǎn)基因型易感性分析[n(%)]

2.3不同基因型GDM患者生化指標(biāo)比較 將GDM患者患者按照AluI位點(diǎn)不同基因型進(jìn)行分組生化指標(biāo)比較，AA+Aa基因型患者產(chǎn)前BMI、0 h血糖及HOMA-IR指數(shù)顯著高于aa基因型患者，0 h胰島素顯著低于aa基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。RsaI位點(diǎn)與GDM無(wú)易感性，未做分析。

表3 不同基因型GDM患者生化指標(biāo)比較

3 討 論

GDM是一種妊娠期女性首次被檢測(cè)出糖耐量或糖代謝異常疾病，多發(fā)于妊娠中晚期，雖然多數(shù)GDM患者在產(chǎn)后可恢復(fù)正常糖代謝，但是在妊娠過(guò)程中其仍然是孕婦、新生嬰兒相關(guān)疾病主要危險(xiǎn)因素之一。GDM不僅會(huì)增加孕婦妊娠意外概率，還可因?yàn)殚L(zhǎng)期高濃度血糖導(dǎo)致抗感染能力下降而發(fā)生生殖系統(tǒng)感染，此外GDM還可導(dǎo)致分娩結(jié)果改變、早產(chǎn)、巨大嬰兒及孕婦遠(yuǎn)期糖尿病等，危及產(chǎn)婦及新生兒安全[1-2]。雌激素是女性內(nèi)分泌系統(tǒng)中重要激素之一，在妊娠早期生理濃度的雌激素可通過(guò)上調(diào)胰島素受體表達(dá)來(lái)增加脂肪、肌肉組織胰島素敏感度[6]，但是當(dāng)孕周增加至中晚期妊娠時(shí)體內(nèi)雌激素濃度增加，相對(duì)高濃度雌激素會(huì)通過(guò)影響胰島素受體表達(dá)及對(duì)抗孕激素作用，導(dǎo)致機(jī)體血糖利用能力下降，出現(xiàn)妊娠期糖尿病[7]。介導(dǎo)雌激素生物學(xué)效應(yīng)的主要是ERα和ERβ，有研究顯示控制這兩種受體表達(dá)的基因會(huì)由于等位基因多態(tài)性而影響其表達(dá)及生物學(xué)功能，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生[5,8]?；蚨鄳B(tài)性是一種較為常見(jiàn)的生理現(xiàn)象，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這一領(lǐng)域也得到更為深入的研究，目前認(rèn)為其與多種疾病遺傳易感性相關(guān)[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ERα基因PvuⅡ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與GDM相關(guān)[10]，但是ERβ基因多態(tài)性與GDM有無(wú)遺傳易感性目前還尚未見(jiàn)報(bào)道。

ERβ基因位于染色體14q23.2，有兩種常見(jiàn)基因多態(tài)性位點(diǎn)，RsaI位點(diǎn)：在ERβ基因5號(hào)外顯子配體結(jié)合區(qū)的1 082號(hào)核苷酸由于點(diǎn)突變會(huì)出現(xiàn)RsaI內(nèi)切酶特異性識(shí)別位點(diǎn)；AluI位點(diǎn)：ERβ基因8號(hào)外顯子3，端非編碼區(qū)的1 730號(hào)核苷酸發(fā)生點(diǎn)突變出現(xiàn)AluI內(nèi)切酶特異性識(shí)別位點(diǎn)[11]。ERβ基因RsaI位點(diǎn)、AluI位點(diǎn)多態(tài)性被證實(shí)與多種臨床疾病相關(guān)。SHOUKRY等[12]對(duì)200例絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松患者RsaI位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)R基因可能與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥易感性相關(guān)，而另一等位基因r則是該病的保護(hù)因素?；诖萍に丶按萍に厥荏w在孕期中的動(dòng)態(tài)變化，ERβ基因多態(tài)性也是妊娠相關(guān)疾病研究熱點(diǎn)。DOMNGUEZ等[13]在圍生期抑郁發(fā)病危險(xiǎn)因素研究中發(fā)現(xiàn)AluI位點(diǎn)A等位基因呈差異性，風(fēng)險(xiǎn)分析顯示A等位基因是圍生期抑郁高危因素。殷艷等[14]的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，AluI位點(diǎn)A基因是維吾爾族婦女妊娠期膽內(nèi)膽汁淤積癥風(fēng)險(xiǎn)因素，而RsaI位點(diǎn)R等位基因是其保護(hù)因素。

本研究對(duì)GDM患者ERβ基因多態(tài)性進(jìn)行分析，GDM組與對(duì)照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，提示選擇對(duì)象具有群體代表性。研究結(jié)果顯示GDM組AluI位點(diǎn)基因型與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AA、Aa基因型孕婦會(huì)增加GDM患病風(fēng)險(xiǎn)，A等位基因可能是GDM易感性基因。RsaI位點(diǎn)各基因型在GDM組、對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亦與GDM無(wú)易感相關(guān)性。GDM主要表現(xiàn)為血糖、胰島素異常及胰島素抵抗現(xiàn)象，且雌激素受體在孕期中與糖代謝密切相關(guān)，本研究選擇與GDM具有易感相關(guān)性的AluI位點(diǎn)基因進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析，結(jié)果顯示，AA+Aa基因型患者血糖、胰島素抵抗高于aa基因型，而胰島素低于aa基因型，與該位點(diǎn)基因型在GDM、健康人群中分布結(jié)果相符。本研究推測(cè)a等位基因調(diào)控的相關(guān)蛋白可能在雌激素信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)影響信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)控終端胰島素敏感性[15]，該基因型可能具有更高效胰島素利用功能。

4 結(jié) 論

通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，ERβ基因AluI位點(diǎn)多態(tài)性可能與GDM易感性相關(guān)，A等位基因具有高GDM患病風(fēng)險(xiǎn)，且A等位基因患者糖代謝異常更為嚴(yán)重。本研究成果豐富了GDM的遺傳因素相關(guān)理論，為GDM預(yù)防和后期干預(yù)提供新的依據(jù)。但是本研究還存在一定局限性，如樣本例數(shù)較少、非多中心研究等，還需加強(qiáng)后續(xù)研究，以期進(jìn)一步明晰GDM遺傳易感性機(jī)制。