任碧瓊，田雪飛△，陳 園，徐 飛

(1.湖南省第二人民醫(yī)院/湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南長沙 410208)

正常情況下血液在血管中保持流動狀態(tài)是因?yàn)闄C(jī)體的凝血與抗凝血、纖溶與抗纖溶系統(tǒng)維持一種動態(tài)平衡，物理、化學(xué)、炎癥及代謝性疾病等多種因素均可打破這種平衡導(dǎo)致血栓形成[1]。由于血栓形成伴隨各種炎性反應(yīng)[2-4]，因此血栓性疾病的防治不僅需要抗凝，還需要抗炎。中藥成分姜黃素及姜黃提取物均具有抗炎作用[5-6]，為了探討姜黃素及姜黃提取物對血栓性疾病的治療作用的機(jī)制，本研究分別用姜黃素及姜黃提取物對大鼠進(jìn)行灌胃處理，然后采用物理方法導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷啟動內(nèi)源性凝血途徑建立大鼠血栓模型，采用假手術(shù)組作為對照組，收集各組大鼠血漿，檢測血漿活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時間(TT)及抗凝血酶3(AT3)的變化，比較各組之間的差異，初步探討姜黃素及姜黃提取物對血栓模型大鼠血漿中凝血指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步研究姜黃素及姜黃提取物的作用機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1姜黃素及姜黃提取物 姜黃素購自美國Sigma公司，批號：SLBN7214V；姜黃提取物由湖南中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供，其中姜黃素含量為4.95%。姜黃素低劑量為100 mg/(kg·d)，姜黃素高劑量為500 mg/(kg·d)；姜黃提取物組按比例換算使姜黃素含量與姜黃素組保持一致，低劑量為2 020 mg/(kg·d)，高劑量為10 100 mg/(kg·d)。

1.2姜黃素、姜黃提取物處理及大鼠血栓模型的建立 分組：選用SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量在 300～450 g，將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、血栓模型組，姜黃素低劑量處理組、姜黃素高劑量處理組、姜黃提取物低劑量組、姜黃提取物高劑量處理組，每組各10只。

處理：假手術(shù)對照組及血栓模型組采用蒸餾水灌胃，其他4組分別用姜黃素及姜黃提取物高、低劑量連續(xù)灌胃15 d，然后進(jìn)行造模手術(shù)，術(shù)后24 h開腹取栓，手術(shù)顯微鏡下觀察下腔靜脈 (IVC)形態(tài)及側(cè)枝靜脈開放代償程度，切取結(jié)扎線下方IVC段，以磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗IVC及髂靜脈，收集血栓，并檢測質(zhì)量。取 IVC段，行蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察血栓形成情況。

1.36組大鼠血漿APTT、FIB、TT及AT3的檢測 采用日本希森美康公司生產(chǎn)的全自動凝血分析儀CA7000分別檢測6組大鼠血漿APTT、FIB、TT及AT3水平，所有試劑均為日本希森美康CA7000配套試劑，隨臨床常規(guī)標(biāo)本一同檢測，質(zhì)量控制遵照SOP文件采用高、低兩個濃度水平質(zhì)控物，在控方可進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素及姜黃提取物對血栓大鼠模型血漿APTT、FIB的影響 與假手術(shù)組大鼠相比，血栓模型鼠組血漿APTT顯著延長(P=0.011)，低劑量、高劑量姜黃素灌胃均使血栓模型鼠血漿APTT縮短(P=0.02,P<0.001)，而低劑量、高劑量姜黃提取物灌胃組則使APTT進(jìn)一步延長(P<0.001,P=0.019)，見圖1A、B；與假手術(shù)組相比，血栓模型組、低劑量姜黃素及高劑量姜黃素灌胃組血漿FIB顯著升高(P=0.017，P=0.003，P=0.001)；與假手術(shù)組相比，血栓模型組、低劑量姜黃提取物及高劑量姜黃提取物灌胃組血漿FIB水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P=0.005，P=0.011)，見圖1C、D。

2.2姜黃素及姜黃提取物對血栓模型鼠血漿TT、AT3的影響 與假手術(shù)組大鼠相比，血栓模型組大鼠血漿TT、AT3差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，低劑量、高劑量姜黃素灌胃組血漿TT均顯著降低(P=0.03,P=0.001),而低、高劑量姜黃提取物灌胃組血漿TT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2A、B；姜黃素、姜黃提取物灌胃對血栓大鼠模型血漿AT3的影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2C、D。

注：A為姜黃素對APTT的影響；B為姜黃提取物對APTT的影響；C為姜黃素對FIB的影響；D為姜黃提取物對FIB的影響

圖1姜黃素及姜黃提取物對血栓模型鼠血漿APTT及FIB的影響

注：A為姜黃素灌胃對TT的影響；B為姜黃提取物灌胃對TT的影響；C為姜黃素灌胃對AT3的影響；D為姜黃提取物灌胃對AT3的影響

圖2姜黃素及姜黃提取物對血栓模型鼠血漿TT及AT3的影響

3 討 論

姜黃素的抗炎機(jī)制主要是抑制炎癥因子的產(chǎn)生[7]。由于普遍認(rèn)為姜黃提取物中的有效成分主要是姜黃素，因此很少有單獨(dú)研究姜黃提取物作用機(jī)制的報道。然而姜黃提取物的成分是很復(fù)雜的，不僅含有一定比例的姜黃素，還有甲氧基姜黃素及雙脫甲氧基姜黃素[8]，還有其他未知成分。本研究發(fā)現(xiàn)，就姜黃素、姜黃提取物對血栓模型大鼠的凝血因子的影響來看，它們有著較大的差異，姜黃素灌胃處理組大鼠血漿APTT時間縮短，而姜黃提取物灌胃組大鼠APTT時間延長，這就意味著姜黃素和姜黃提取物對血栓性疾病中有著截然不同的作用機(jī)制。

APTT主要反映內(nèi)源性凝血途徑的相關(guān)凝血因子，血栓性疾病處于高凝狀態(tài)時APTT是縮短的[9]，但在血栓形成的過程中凝血因子被消耗，最終便會導(dǎo)致APTT延長，本研究中血栓模型大鼠血漿APTT時間比假手術(shù)組大鼠延長也證明了這一點(diǎn)。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、高劑量的姜黃素灌胃處理的抗凝作用不明顯，相反有一定的緩解APTT時間延長的作用，說明姜黃素的抗炎作用并不是通過活血化瘀，而是有著阻止出血的作用；而低、高劑量的姜黃提取物灌胃處理的血栓模型大鼠血漿APTT時間均延長，說明姜黃提取物有著較強(qiáng)的抗凝活性，這種抗凝作用用中醫(yī)理論來形容便是活血化瘀的功效。

姜黃素與姜黃提取物灌胃組大鼠FIB、TT及AT3的改變也各不相同，與血栓模型組相比，姜黃素灌胃組FIB變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但TT時間呈縮短趨勢；姜黃提取物灌胃組FIB的變化也不明顯，但TT時間有延長趨勢，說明姜黃素有促使凝血酶形成的作用，也就是阻止出血的作用，而姜黃提取物則有阻滯凝血酶形成的作用，也就是抗凝作用；對AT3的影響也是姜黃素灌胃有使其降低的趨勢，姜黃提取物灌胃則有使其呈升高趨勢，進(jìn)一步說明了姜黃素的促凝作用及姜黃提取物的抗凝作用。多項結(jié)果均顯示二者在凝血方面起著相反的作用，究其原因可能與它們的分子結(jié)構(gòu)差異和成分差異有關(guān)，姜黃素為單一成分，而姜黃提取物包含有甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素以及其他成分。灌胃時為了保證姜黃素的作用一致，將姜黃提取物中姜黃素的含量調(diào)整到與姜黃素相同，但同時也放大了甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素及其他成分的作用[10]，這是否正是引起凝血改變各異的主要原因還需要進(jìn)一步研究。有研究報道姜黃提取物對小鼠肝纖維化的改善作用與姜黃素的效果相當(dāng)[11]，但本文的研究提示即使二者在疾病治療中有著同樣的功效，其作用機(jī)制也是各不相同的。周麗娟等[12]的研究結(jié)果顯示，不同來源姜黃提取物抗肝損傷作用各異，此差異原因可能與姜黃的不同產(chǎn)地及化學(xué)成分有關(guān)，但他們后來的研究又表明不同商品規(guī)格、等級姜黃提取物含量有差異，但具有相似的抗氧化活性，且該活性與姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素含量無量效關(guān)系[13]。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素及姜黃提取物灌胃處理對造模大鼠血漿APTT、FIB、TT及AT3的影響有著較大的差異，姜黃素表現(xiàn)出促凝作用，而姜黃提取物處理表現(xiàn)出明顯的抗凝作用，初步推測這種區(qū)別與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，但需進(jìn)一步證實(shí)。對于二者作用機(jī)制的研究有利于更加合理地將二者用于疾病的治療，本研究為進(jìn)一步探討姜黃素及姜黃提取物的作用機(jī)制提供了新的研究方向。