劉國(guó)紅 劉琴英，2 劉波 車建美 陳倩倩

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003；2. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117）

芽胞桿菌（Bacillus）是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧，能夠產(chǎn)生對(duì)熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)抗性的芽胞，因此能忍受多種不良環(huán)境。芽胞桿菌是土壤微生物的重要組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。有些芽胞桿菌可以在高酸、高堿、高溫、高寒等極端環(huán)境下良好生長(zhǎng)，具有較大的生態(tài)學(xué)價(jià)值。近幾年，陸續(xù)有關(guān)不同生態(tài)條件下土壤芽胞桿菌數(shù)量和種類分布的研究文獻(xiàn)報(bào)道。劉國(guó)紅等［1］報(bào)道了新疆伊犁馬鈴薯土壤中芽胞桿菌多樣性，劉琴英等［2］調(diào)查了四川海螺溝冰川土樣中的芽胞桿菌資源，葛慈斌等［3］首次調(diào)查了武夷山各種地衣的表生和內(nèi)生芽胞桿菌種類多樣性，張華勇等［4］對(duì)紅壤地區(qū)不同生態(tài)系統(tǒng)下芽胞桿菌屬內(nèi)的物種多樣性進(jìn)行了分析，表明芽胞桿菌的多樣性指數(shù)、種類豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)隨生境的不同從林地、旱地、水田、侵蝕地呈遞減趨勢(shì)。

四川省生態(tài)資源豐富多樣，蘊(yùn)藏著豐富的微生物種類。馬健華［5］從四川若爾蓋高原37份土樣中分離獲得78株芽胞桿菌，分別屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）和類芽胞桿菌屬（Paneibacillus）3個(gè)屬。胡容平等［6］調(diào)查發(fā)現(xiàn)四川甘孜州折多山與雀兒山地區(qū)土壤細(xì)菌豐富多樣，主要優(yōu)勢(shì)類群為芽胞桿菌。目前，主要是對(duì)四川森林土壤微生物多樣性研究［7-9］，專門針對(duì)芽胞桿菌種類分布的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究將對(duì)四川和重慶農(nóng)林生態(tài)區(qū)林地和農(nóng)地土壤中芽胞桿菌種類進(jìn)行調(diào)查分析，以期為芽胞桿菌資源開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)和提供菌種保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 采集深度范圍為0-15 cm或0-20 cm。各樣點(diǎn)采集的樣品采后裝入無菌袋內(nèi)，立即帶回實(shí)驗(yàn)室供實(shí)驗(yàn)分析用。樣品的具體信息，見表1。

表 1 供試土樣信息

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 PCR儀和凝膠成像分析儀（Bio-Rad公司）；恒溫培養(yǎng)箱（BI-250AG）購(gòu)自施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；2×PCR Master Mix購(gòu)自上海鉑尚生物技術(shù)有限公司；引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉5.0 g，pH 7.2-7.4，瓊脂15.0 g，水1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離與鑒定 土壤中芽胞桿菌的分離參考劉國(guó)紅等［10］描述的方法，將10 g土壤與90 mL無菌水振蕩20 min混勻，80℃水浴15 min，依次稀釋涂板，30℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行觀察。每份土樣重復(fù)3次。根據(jù)菌落形態(tài)特征等進(jìn)行芽胞桿菌種類歸類、統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)及純化，采用-80℃甘油冷凍法進(jìn)行保存。采用Tris-飽和酚法提取芽胞桿菌基因組DNA。采用通用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，主要參考Liu等［11］描述的方法。16S rRNA基因擴(kuò)增引物為 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。檢測(cè)出有條帶的菌株P(guān)CR產(chǎn)物送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 芽胞桿菌資源系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)所得到序列在網(wǎng)站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上進(jìn)行序列比對(duì)分析后［12］，初步判斷得出芽胞桿菌的分類地位。選擇相關(guān)的參考菌株序列，再經(jīng)Clustal X對(duì)齊后［13］，用軟件Mega 6.0采用鄰接法和Jukes-Cantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14-17］。

1.2.3 芽胞桿菌資源多樣性分析 統(tǒng)計(jì)農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌種類數(shù)、菌落數(shù)，以芽胞桿菌種類為樣本，以菌落數(shù)量為指標(biāo)，采用Ward's方法和歐式距離模型、利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20進(jìn)行聚類分析。比較分析各樣本芽胞桿菌種類的分布情況。采用物種多樣性分析常用的指數(shù)Pielou均勻度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)討論不同采樣地嗜堿芽胞桿菌物種多樣性。

式中，S為總芽胞桿菌種類數(shù)，N為芽胞桿菌個(gè)體總數(shù)，Pi是第i種的個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例。

2 結(jié)果

2.1 芽胞桿菌資源的分離與鑒定

從四川和重慶農(nóng)林生態(tài)區(qū)采集的5份樣本中共分離獲得了芽胞桿菌95株，經(jīng)形態(tài)特征比較，除去冗雜菌株，選取57株菌為代表菌株進(jìn)行下一步分析。經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定，57株菌判斷為7個(gè)屬38個(gè)種，其中芽胞桿菌屬（Bacillus）22個(gè)種、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinbacillus）4個(gè)種、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）7個(gè)種、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）2個(gè)種、嗜冷芽胞桿菌屬（Psychrobacillus）1個(gè)種、魯梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）1個(gè)種和虛構(gòu)芽胞桿菌屬（Fictibacillus）1個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬為優(yōu)勢(shì)種群，包含41株菌，占68.3%，其次為類芽胞桿菌屬包含7株，占11.7%。根據(jù)國(guó)際細(xì)菌種的定義標(biāo)準(zhǔn)，兩菌間16S rRNA相似性低于98.65%，6株菌可能為潛在芽胞桿菌新種（表2）。

2.2 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌可分為4大類群（圖1）。第I類群為枯草芽胞桿菌類群，包含21株菌15個(gè)種。其中3株菌可能為芽胞桿菌屬的潛在新種，F(xiàn)JAT-25496與其最相近匹配模式菌株Bacillus oceanisediminisH2T的16S rRNA基因相似為97.6%，F(xiàn)JAT-25547與其最相近匹配模式菌株Bacillushorneckiae的16S rRNA基因相似為97.7%，F(xiàn)JAT-25550與其最相近匹配模式菌株Bacillus mesophilum的16S rRNA基因相似為98.1%。第II類群主要為蠟樣芽胞桿菌類群和1株Fictibacillus barbaricusFJAT-25574，其中FJAT-25509為潛在新種，與其最匹配模式菌株的16S rRNA基因相似為97.0%。第III類群為類芽胞桿菌科，包含類芽胞桿菌屬和短芽胞桿菌屬2個(gè)屬，其中類芽胞桿菌的7個(gè)種和短芽胞桿菌2個(gè)種。第IV類群主要為賴氨酸芽胞桿菌屬及1株Rummeliibacillus pycnusFJAT-25531和1株P(guān)sychrobacillus psychroduransFJAT-25571。其中，潛在新種FJAT-25531與其最相近匹配模式菌株Lysinibacillus macroides的16S rRNA基因相似為92.0%，F(xiàn)JAT-25571與其最相近匹配模式菌株P(guān)sychrobacillus psychrodurans的16S rRNA基因相似為98.6%。

2.3 農(nóng)林生態(tài)區(qū)芽胞桿菌的分布

Shannon指數(shù)多樣性分析得出，土壤芽胞桿菌Shannon指數(shù)大小依次為樂山林地＞鹽亭縣農(nóng)地＞重慶林地＞鹽亭縣林地，均勻度指數(shù)依次為鹽亭縣林地＞樂山林地＞重慶林地＞鹽亭縣農(nóng)地（表3）。

以芽胞桿菌種類為樣本，以芽胞桿菌種類含量為指標(biāo)，當(dāng)歐式距離λ=15時(shí)，可分為兩大類群（圖2）。第I類群為高含量廣分布型，包含7個(gè)種，分布在3-4個(gè)采集點(diǎn)，分別是韋氏芽胞桿菌、解木糖賴氨酸芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、嗜冷芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、阿氏芽胞桿菌、簡(jiǎn)單芽胞桿菌、奇異虛構(gòu)芽胞桿菌和圖瓦永芽胞桿菌，此群主要特征為芽胞桿菌種類或含量很高，或者分布廣，其中圖瓦永芽胞桿菌和解木糖賴氨酸芽胞桿菌在所有采集點(diǎn)均有分離到；第II類群特征含量低分布不均勻型，僅分布在一個(gè)或2個(gè)地點(diǎn)，包含除第一群種類的所有芽胞桿菌種類。

2.4 林地生態(tài)區(qū)芽胞桿菌資源分布比較

林地生境類型土壤中芽胞桿菌資源種類具有不同的分布特征。鹽亭縣林地中芽胞桿菌菌落含量最高，達(dá)1.99×105CFU/g，而忠縣林地的最少，僅為3.07×103CFU/g。多樣性指數(shù)分析表明，不同地理分布林地的香農(nóng)指數(shù)相近，樂山林地的最高，而鹽亭縣林地的最低。鹽亭縣林地土壤中的優(yōu)勢(shì)種群主要為簡(jiǎn)單芽胞桿菌，樂山林地的為短短芽胞桿菌，忠縣林地的為解木糖賴氨酸芽胞桿菌。

表2 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌的16S rRNA基因鑒定

圖1 基于16S rRNA基因的農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

表3 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌多樣性指數(shù)

圖2 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌種類含量聚類分析

2.5 林地和農(nóng)地芽胞桿菌資源多樣性比較

不同生境類型土壤中的芽胞桿菌資源含量和種群結(jié)構(gòu)差異較大，農(nóng)地中的芽胞桿菌含量明顯高于林地，農(nóng)地的菌落含量平均為1.95×105CFU/g，林地的為0.80×105CFU/g。農(nóng)地生境類型的芽胞桿菌優(yōu)勢(shì)種群為韋氏芽胞桿菌，但在林地中未分離獲得此種群。林地的優(yōu)勢(shì)種簡(jiǎn)單芽胞桿菌和短短芽胞桿菌亦未在農(nóng)地中獲得。

3 討論

土壤是微生物生存的大本營(yíng)，不同生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境中，土壤中芽胞桿菌種類資源種群分布具有一定的差異。葛慈斌等［18］利用可培養(yǎng)方法了解了武夷山自然保護(hù)區(qū)芽胞桿菌分布狀況，芽胞桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，其次為類芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬。龔國(guó)淑等［19］通過可培養(yǎng)法從成都市郊區(qū)表層土樣共分離到芽胞桿菌21個(gè)種，環(huán)狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌為優(yōu)勢(shì)種群。胡樺等［9］分析四川和重慶紫色土中硅酸鹽細(xì)菌多樣性，主要為膠胨樣芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus），還首次發(fā)現(xiàn)硅酸鹽細(xì)菌分布在蠟樣芽胞桿菌中。東寨港紅樹林土壤中含有大量的芽胞桿菌，存在較為豐富的遺傳多樣性，通過熱處理法分離獲得芽胞桿菌6個(gè)屬的種類［20］。宋敏等［21］調(diào)查了永興島土壤中芽胞桿菌資源發(fā)現(xiàn)，該生境中優(yōu)勢(shì)種群為芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬。呂剛［22］調(diào)查了河南省土壤芽胞桿菌多樣性，獲得了芽胞桿菌5個(gè)屬即芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬、鳥氨酸芽胞桿菌屬（Ornithinibacillus）、短芽胞桿菌屬和類芽胞桿菌屬。優(yōu)勢(shì)種是巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）和簡(jiǎn)單芽胞桿菌（Bacillus simplex）。上述研究結(jié)果表明，土壤中含有豐富的芽胞桿菌資源，芽胞桿菌屬為主要優(yōu)勢(shì)種，不同生境類型下芽胞桿菌的種群組成具有一定的差異。

本研究從四川和重慶采集的土壤樣本中共分離獲得芽胞桿菌7個(gè)屬的38個(gè)種，芽胞桿菌屬為所有生境中的優(yōu)勢(shì)屬，優(yōu)勢(shì)種為圖瓦永芽胞桿菌、簡(jiǎn)單芽胞桿菌、短短芽胞桿菌和解木糖賴氨酸芽胞桿菌，這與上述研究中優(yōu)勢(shì)種群不一致。本研究中的芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬為不同生境的共有屬，這與永興島土壤的研究結(jié)果基本一致；而短芽胞桿菌屬、嗜冷芽胞桿菌屬、魯梅爾芽胞桿菌屬和虛構(gòu)芽胞桿菌屬4個(gè)屬僅在1個(gè)樣本出現(xiàn)，為本研究的特有屬。本研究未獲得河南省土壤中發(fā)現(xiàn)的Ornithinibacillus，而嗜冷芽胞桿菌屬、魯梅爾芽胞桿菌屬和虛構(gòu)芽胞桿菌屬亦未在河南省土壤中發(fā)現(xiàn)，這可能與土壤類型和地理位置有一定關(guān)系。本研究結(jié)果表明農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤樣本中芽胞桿菌的菌落數(shù)量為3.07×103-1.99×105CFU/g干土，與龔國(guó)淑等［19］調(diào)查的成都郊區(qū)土壤中的芽胞桿菌數(shù)量（4.30×103-8.53×105CFU/g干土）具有一致性。

根據(jù)國(guó)際細(xì)菌種的定義標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)未知菌株與其最相近模式菌株間的16S相似性低于98.65%時(shí)，未知菌株可能為新種［23］。本研究從四川和重慶農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中發(fā)現(xiàn)6株芽胞桿菌與其相近菌的16S相似性低于種的界限閾值，為芽胞桿菌潛在新種。其中1株已在IJSEM正式發(fā)表［11］，另外5株需要多相分類指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證確定其準(zhǔn)確的分類地位。

芽胞桿菌多樣性指數(shù)分析表明，樂山林地芽胞桿菌的Shannon指數(shù)最高，而鹽亭縣林地的最低。同種芽胞桿菌在不同的環(huán)境條件下分布不同，如解木糖賴氨酸芽胞桿菌在所有樣本均存在，短短芽胞桿菌僅在樂山林地土壤中獲得且為其優(yōu)勢(shì)種。駱婷等［24］調(diào)查發(fā)現(xiàn)森林土壤中較高的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，并篩選獲得了具有多功能降解作用的類芽胞桿菌。不同區(qū)域間的物種存在著差異性，其優(yōu)勢(shì)種也具有一定的差異，如鹽亭縣農(nóng)地生境類型的優(yōu)勢(shì)芽胞桿菌種群為韋氏芽胞桿菌，鹽亭縣林地的優(yōu)勢(shì)種群為簡(jiǎn)單芽胞桿菌。本研究表明農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中蘊(yùn)藏著豐富的芽胞桿菌資源，且含有一定的新資源，為芽胞桿菌新資源挖掘和功能菌株開發(fā)提供了保障。

4 結(jié)語

從四川省和重慶市農(nóng)林生態(tài)區(qū)采集的5份土壤樣品中分離獲得芽胞桿菌95株，去重復(fù)后選取57株，通過細(xì)菌通用引物16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、比對(duì)，鑒定57株菌為芽胞桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinbacillus）、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）、嗜冷芽胞桿菌屬（Psychrobacillus）、魯梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）和虛構(gòu)芽胞桿菌屬（Fictibacillus），其中優(yōu)勢(shì)屬為芽胞桿菌屬。根據(jù)細(xì)菌種的界定閾值16S rRNA小于98.65%，發(fā)現(xiàn)6株分離菌為潛在芽胞桿菌新種。芽胞桿菌種類可分為高含量分布廣型和低含量分布不均勻型，農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌多樣性指數(shù)依次為樂山林地＞ 鹽亭縣農(nóng)地＞ 重慶。