吳國訪，張淑沛

（河南省漯河市第六人民醫(yī)院 神經內科，河南 漯河 462002）

近年來阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）的發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)急劇上升，目前普遍采用改善腦循環(huán)藥物、能量代謝促進劑及乙酰膽堿酯酶抑制劑等治療，但療效有限[1]，而針對AD病因進行分子水平的治療，可能成為改善AD癥狀、治愈AD的新方向。

神經細胞損傷及凋亡是AD的病理機制，而氧化應激損傷在神經退行性病變中具有重要的病因學意義[2]，目前，調控Wnt（wingless/integrated）信號通路對改變β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein,Aβ）誘導的PC12細胞氧化損傷的作用尚少見報道。本實驗中選用PC12細胞株作為實驗材料，研究Wnt3a對Aβ25-35誘導PC12細胞損傷的作用，闡明其對對抗氧化損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞（中國科學院細胞所）。

1.2 試劑

Bax（Sigma），Wnt3a（Sigma），細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC,PI雙染）（凱基生物）。Bcl-2（Sigma），β-actin抗 體（Stanta Cruz），Amyloidβ（25-35）（human）（Sigma）。

1.3 方法

1.3.1 PC12細胞培養(yǎng) PC12細胞接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15%小牛血清DMEM。每3 d換液一次，3～4 d以1∶5進行傳代。

1.3.2 AD模型制備 采用Aβ25-35誘導PC12細胞損傷制備AD模型：收集對數(shù)生長期的PC12細胞，重懸后以5×105/cm2的密度接種在6孔板表面生長。細胞長至80%融合時，換成新鮮培養(yǎng)基，其中含梯度濃度（10～50 μmol/L）Aβ25-35。加藥24 h，收集細胞進行檢測。

1.3.3 實驗分組 根據損傷實驗結果，確定實驗Aβ25-3530 μmol/L培養(yǎng)基中加入經典Wnt通路的 激 活 50 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml Wnt3a，48 h以后收集細胞進行觀察和檢測。即實驗設5組：①正常對照組；②Aβ25-35組；③Aβ25-35+50 ng/ml Wnt3a組；④Aβ25-35+100 ng/ ml Wnt3a組；⑤Aβ25-35+200 ng/ml Wnt3a。

1.3.4 WST-1法檢測細胞的增殖活力 96孔培養(yǎng)版加入每組PC12細胞5 000個/孔。20 h后加入含WST-1溶液的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS），30℃孵育1 h后，震蕩3 min，讀取吸光度（optical density,OD）值，存活百分率=OD處理組/OD無處理組×100%。

1.3.5 流式細胞儀檢測凋亡百分率 收集各組細胞，70%冰酒精固定30 min，加碘化丙啶（propidium iodide,PI）10 ng/ml及脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）抑制劑100 u/ ml室溫孵育20 min。使用流式細胞儀測定各組的細胞周期，計算凋亡百分率。

1.3.6 Western Blot檢測Tau蛋白磷酸化 各組中加細胞裂解液100 μl、PMSF2 μl，收集細胞，移至EP管后置于冰上10 min，4℃，1 000 r/min，離心10 min。取上清液后加入80 μl buffer重懸，水浴5 min。經電泳、轉膜、加入抗體過夜反應后，暴光顯影、定影后拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

用統(tǒng)計學軟件SPSS l3.0對數(shù)據進行處理。實驗數(shù)據為計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Aβ25-35對PC12細胞的增殖活力影響

順梯度濃度的Aβ25-35與PC12細胞孵育24 h，顯示隨著Aβ25-35濃度的遞增細胞活力降低，結合細胞形態(tài)觀察，本實驗選取30 μmol/L作為Aβ25-35誘導AD細胞模型的適宜濃度，及進行后續(xù)研究。見圖1。

2.2 Wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞增殖活力影響

細胞接種24 h后除對照組外其余均加入30 μmol/L Aβ25-35，后加入不同濃度（50、100、200 ng/ml）Wnt3a 48 h，如圖2所示PC12細胞依賴Wnt3a濃度的增加而存活率升高，在濃度 100 ng/ml時達到最佳值50、100、200 ng/ml Wnt3a對應的細胞存活率與對照組相比，t值分別為2.621、9.877、16.326，P值分別為0.027、0.012、0.005。見圖2。

2.3 Wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞形態(tài)和生長的影響

30 μmol/L作 為 Aβ25-35誘導AD細胞模型的適宜濃度，每個實驗組分別加50 ng/ml、100 ng/ ml、200 ng/ml Wnt3a持續(xù)到48 h。觀察細胞形態(tài)及生長情況，見圖3。

2.4 Wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞凋亡的影響

流式細胞檢測顯示Wnt3a呈濃度依賴性的降低細胞凋亡率，但100與200 ng/ml Wnt3a對細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

2.5 Wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞Bax、Bcl-2表達的影響

PC12細胞經30 μmol/L Aβ25-35處理后與正常對照組比較，胞質中Bax表達明顯升高（t值2.284，P值0.004），而Bcl-2表達減少不明顯（t值0.035，P值0.594），Bax/Bcl-2比值升高（t值6.894，P值0.015）；與Aβ25-35組相比顯示，加50 ng/ml Wnt3a組Bax表達有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（t值0.059，P值0.915），Bcl-2表達略有升高；加100 ng/ml組Bax表達明顯下降（t值12.985，P值0.000），Bcl-2表達明顯升高（t值15.982，P值0.001）。見圖5。

圖1 Aβ25-35對PC12細胞增殖活性的影響（n =6）

圖2 wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞增殖活性的影響（n =6）

圖3 細胞形態(tài)及生長情況

圖4 Wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞凋亡的影響

圖5 Wnt3a對Aβ25-35誘導后PC12細胞Bax、Bcl-2表達的影響

3 討論

阿爾茨海默病是一種進行性神經退行性疾病，臨床表現(xiàn)包括進行性記憶減退、認知功能障礙等，病理顯示大腦皮質和海馬區(qū)神經細胞的丟失。機體的氧化損傷即機體內產生的氧自由基得不到及時清除，導致活性氧在體內堆積引起細胞毒性，是機體各組織老化的重要誘因，AD患者體內自由基生成增加，尤其是腦組織中神經細胞的氧化應激是導致其腦結構和功能改變的原因之一[3]。

Aβ是AD發(fā)病的始動因素[4]，一方面Aβ能夠影響細胞骨架的完整性[5]，另一方面，Aβ還能干擾線粒體的功能障礙，導致培養(yǎng)基內的神經細胞受到氧化損傷[6]，因而Aβ成為AD治療的重要靶標[7]。

Wnts調節(jié)細胞的生長過程，包括細胞的增殖、運動及凋亡，研究表明在Wnt信號途徑轉導中Wnt3a蛋白分子不僅保護細胞，還能增強細胞活力，其作用可能與Wnt3a抑制過氧化氫（H2O2）誘導細胞線粒體凋亡有關[8]。

本研究利用WST-1法檢測細胞的增殖活力間接測線粒體酶的活力反映細胞活力，結果表明Aβ25-35與PC12細胞孵育能抑制WST-1代謝率，說明Aβ25-35對細胞線粒體功能造成障礙；Wnt3a能濃度依賴性改善WST-1代謝率，在Wnt3a100 ng/ml達到最佳值，表明Wnt3a對Aβ25-35釋放毒性造成的線粒體損傷具有保護作用。形態(tài)學觀察表明30 μmol/L Aβ25-35能使PC12細胞由菱形變成了扁形，表明細胞發(fā)生損傷；Wnt3a則能改善細胞的形態(tài)，表明Wnt3a能增加存活細胞數(shù)目。Annexin V/PI雙染法顯示Aβ25-35處理PC12細胞24 h后細胞損傷的主要形式是早期凋亡，Wnt3a100 ng/ml能減少早期凋亡細胞數(shù)目。

細胞凋亡與抗凋亡之間存在一種平衡，任何導致細胞凋亡啟動分子均可促使細胞凋亡的發(fā)生自由基可通過線粒體依賴途徑導致細胞凋亡[9]。Aβ25-35誘導PC12細胞Bcl-2表達下降，Bax表達上升，Bcl-2/Bax比值降低；Wnt3a 100 ng/ml與模型組比較Bcl-2表達上調，升高Bcl-2/Bax的比值升高，表明Wnt3a能抑制Aβ25-35引起的細胞凋 亡。

總之，Wnt3a可能通過Wnt信號通路抑制H2O2誘導線粒體凋亡通路，進而發(fā)揮保護由Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷。