王 妍 郭 萌 杜小燕 李長龍 路 靜 霍學(xué)云 呂建祎 劉 欣 陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)又名蒙古沙鼠(Mongoliangerbil)，為嚙齒類動(dòng)物家族成員，是源自我國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源[1]。由于其獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)、生理學(xué)和行為學(xué)特征，長爪沙鼠在許多研究領(lǐng)域具有特殊的應(yīng)用價(jià)值，如腦神經(jīng)病研究、寄生蟲病研究、微生物學(xué)研究、聽覺和視覺研究、內(nèi)分泌研究、代謝研究、腫瘤及其他疾病研究[1-2]?？梢哉f，長爪沙鼠被稱為“多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”。隨著長爪沙鼠線粒體和全基因組測(cè)序[2]的完成，以及癲癇易患模型[3]、自發(fā)糖尿病模型[4]、腦缺血高發(fā)群體[5]等長爪沙鼠動(dòng)物模型群體的建立，長爪沙鼠逐漸成為相關(guān)研究領(lǐng)域的一種“熱門”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。近年來，在長爪沙鼠近交系和封閉群培育過程中，我們?cè)谧C實(shí)長爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)(circle of Willis，CoW)變異缺失具有遺傳性的基礎(chǔ)上，通過抑制消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)方法，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C，CST3)的表達(dá)變化與長爪沙鼠腦血管畸形相關(guān)[6]。為了進(jìn)一步研究長爪沙鼠CST3的功能和參與血管發(fā)育的機(jī)制，我們比對(duì)了CST3序列同源性，構(gòu)建了長爪沙鼠CST3蛋白表達(dá)載體，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)和鑒定，為制備長爪沙鼠CST3抗體和進(jìn)行后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部的封閉群長爪沙鼠1只，雄性，16周齡，飼養(yǎng)于普通環(huán)境中(SYXK (京) 2013-0005)。將長爪沙鼠過量麻醉安樂死后，于冰上立即解剖，獲取長爪沙鼠新鮮腦組織。組織采集后保存于液氮中。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

pET28a質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD19-T(Takara，日本)；FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒、E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞、E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞均購自天根公司；TRIzol Reagent(Invitrogen，美國)；NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶(NEB，美國)；IPTG、硫酸卡鈉霉素、氨芐青霉素均購自索萊寶公司。

1.3 方法

1.3.1總RNA提取及cDNA制備: 取約0.1 g腦組織，加入到1 mL TRIzol試劑中進(jìn)行組織勻漿，混勻后室溫消化10 min。加入200 μL三氯甲烷，顛倒混勻后冰上放置15 min，13 500 r/min 4 ℃離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻后冰上放置15 min，13 500 r/min 4 ℃離心15 min，棄上清。加入無核酶冰75%乙醇洗滌沉淀2次，13 500 r/min 4 ℃離心5 min后棄上清。自然風(fēng)干后無核酶水溶解，獲得長爪沙鼠腦組織總RNA。使用Nanodrop 2000c (Thermo scientific, USA) 測(cè)量總RNA濃度和純度，并根據(jù)FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.3.2Cst3基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)(codingsequence，CDS)克隆和測(cè)序:根據(jù)NCBI提供的長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)序列(GenBank: KM517575.1)兩端設(shè)計(jì)Cst3基因CDS區(qū)克隆的上下游引物，上游引物序列為“5’-ATGGCTAGCCCACTACGATCC-3’”、下游引物序列為“5’-TTAAGCGCTTTTGCAGCTGGA-3’”，并用該引物將Cst3基因CDS區(qū)序列從長爪沙鼠腦組織cDNA中擴(kuò)增出來，PCR擴(kuò)增體系為50 μL體系，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)95 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s；72 ℃ 繼續(xù)延伸7 min后，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及膠回收后，將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上進(jìn)行TA克隆測(cè)序，以獲得長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)序列。

1.3.3基因序列同源性比對(duì):在NCBI上查詢小鼠(NCBI Reference Sequence: NM_009976.4)和人類(GenBank: CR542018.1)Cst3基因CDS區(qū)序列，用DNAMAN軟件將其與長爪沙鼠的Cst3基因序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.3.4質(zhì)粒載體構(gòu)建: 去除長爪沙鼠CST3蛋白信號(hào)肽區(qū)域(1～20 aa)后，對(duì)剩余蛋白質(zhì)全長的對(duì)應(yīng)Cst3基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化、在N端加入His標(biāo)簽，并通過化學(xué)合成獲得對(duì)應(yīng)的基因片段，合成的片段通過NcoI和XhoI位點(diǎn)酶切、連接，將合成序列插入到pET28a質(zhì)粒載體中。

1.3.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè):將pET28a-CST3質(zhì)粒和pET28a空質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂板、克隆及培養(yǎng)。用30 mL卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基37 ℃擴(kuò)增菌液，在對(duì)數(shù)擴(kuò)增期加入IPTG誘導(dǎo)，使其終濃度為1 mmol/L。收集菌液后取全菌液上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blotting檢測(cè)。

1.3.6SDS-PAGE凝膠電泳:將各組蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為：80 V恒壓電泳30 min，120 V電泳至結(jié)束。隨后，用考馬斯亮藍(lán)染液染色過夜并進(jìn)行脫色。

1.3.7Western blotting實(shí)驗(yàn):將SDS-PAGE凝膠使用Bio-Rad蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至0.22 μm硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上，用0.5%封閉用脫脂奶粉封閉后，使用His抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌后，用辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗鼠血清二抗室溫孵育1 h。再次充分洗滌后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，用Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集分析。

2 結(jié)果

2.1 長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)克隆測(cè)序分析

為構(gòu)建CST3原核表達(dá)載體，我們首先以長爪沙鼠腦cDNA為模板，擴(kuò)增了Cst3基因CDS區(qū)，并連接到pMD19-T載體上進(jìn)行克隆測(cè)序。利用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)序列比對(duì)。結(jié)果顯示，長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)長度為429 bp，我們克隆的長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)序列與GenBank序列僅相差一個(gè)堿基(圖1)，并導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的差異。

2.2 長爪沙鼠Cst3基因同源性分析

為判斷長爪沙鼠Cst3基因序列同源性，我們利用DNAMAN軟件分別將長爪沙鼠與人、小鼠Cst3基因CDS區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)(圖2)。長爪沙鼠Cst3基因CDS區(qū)序列與人、小鼠的同源性分別為68.90%和79.49%。同時(shí)，我們也比較了長爪沙鼠與人、小鼠CST3蛋白氨基酸序列的同源性。結(jié)果顯示，長爪沙鼠CST3蛋白氨基酸序列與人、小鼠的序列同源性分別為63.51%和71.83%(圖3)。這些比對(duì)結(jié)果顯示，長爪沙鼠Cst3基因與人、小鼠序列同源性較低，保守性較差。這提示，在進(jìn)行長爪沙鼠CST3蛋白研究時(shí)，不宜使用小鼠或人類CST3蛋白或抗體。

2.3 長爪沙鼠CST3蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

為建立長爪沙鼠CST3蛋白體外表達(dá)體系，將長爪沙鼠CST3蛋白與人、小鼠CST3蛋白比對(duì)分析，結(jié)果表明長爪沙鼠CST3蛋白的1～20氨基酸(amino acid，aa)為信號(hào)肽區(qū)域，21～142氨基酸為CST3蛋白功能區(qū)域。由于長爪沙鼠CST3蛋白編碼序列中稀有密碼子較多，GC含量偏高，因此，我們?cè)谌コ蛄兄械男盘?hào)肽后，對(duì)CST3蛋白編碼序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，更換了75個(gè)同義密碼子(圖4)?；瘜W(xué)合成優(yōu)化后的編碼序列，并將其酶切連接到pET28a蛋白表達(dá)載體中構(gòu)建CST3蛋白體外表達(dá)載體，以獲得N端攜帶6X His標(biāo)簽的重組長爪沙鼠CST3蛋白。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果顯示載體序列與預(yù)期一致，帶有His標(biāo)簽的重組長爪沙鼠CST3蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5)。預(yù)計(jì)該重組蛋白總長為143個(gè)氨基酸，其中包含N端6X His標(biāo)簽和沙鼠CST3蛋白21～142 aa，分子量大約為15 kDa。

圖1 長爪沙鼠Cst3 CDS區(qū)克隆測(cè)序與GenBank長爪沙鼠Cst3 CDS區(qū)序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 The alignment analysis between Cst3 CDS sequences we cloned here andGenBank Cst3 CDS sequences of Mongolian gerbils

圖3 長爪沙鼠與人、小鼠CST3蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.3 The alignment analysis of CST3 amino acid sequencesamong Mongolian gerbils, human and mice

圖4 長爪沙鼠CST3蛋白編碼序列密碼子優(yōu)化方案Fig.4 Codon optimization scheme for CST3 coding sequences of Mongolian gerbils

圖5 長爪沙鼠CST3蛋白表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果注：下劃線部分為CST3蛋白編碼序列，加粗黑字為起始密碼子和終止密碼子，黃色陰影為T7啟動(dòng)子，紅色為His標(biāo)簽Fig.5 The partial sequences of recombinant CST3 protein expression vectoNote: The underlined parts are CST3 protein coding sequences, the bold parts were the start codon and the stop codon, the yellow shade parts were the T7 promoter sequences, and the red font parts were the His tag sequences.

2.4 CST3蛋白體外誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

為優(yōu)化蛋白體外表達(dá)條件，我們使用不同濃度和處理時(shí)間的IPTG對(duì)轉(zhuǎn)入重組CST3蛋白表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳顯示，與對(duì)照相比，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)并無特異性蛋白表達(dá)，而1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h后在分子量約15 KDa 處出現(xiàn)單一目的條帶。對(duì)蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)His標(biāo)簽表達(dá)情況，結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)組有特異性His表達(dá)，大小與重組CST3蛋白大小一致，并且His蛋白表達(dá)結(jié)果也表明1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h是誘導(dǎo)沙鼠CST3蛋白表達(dá)的最佳條件(圖6)。綜上，我們成功建立了CST3蛋白體外誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，獲得約15 kDa的重組沙鼠CST3蛋白。

圖6 長爪沙鼠CST3蛋白的體外誘導(dǎo)表達(dá)注：A:SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果；B：Western blotting結(jié)果；M：蛋白marker，1為pET28a載體；2、3、4分別為0.2 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h、8 h和12 h，5、6、7分別為1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h、8 h和12 h，紅箭頭為目的條帶Fig.6 Induced expression of gerbil CST3 protein in vitro.Note: A：SDS-PAGE electrophoresis; B：Western blotting；M：protein ladder; 1, pET28a vector; 2～4,induced by 0.2 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h, 8 h and 12 h, respectively; 5～7,induced by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h, 8 h and 12 h, respectively.Red arrows indicated the target protein

3 討論

半胱氨酸蛋白酶在多個(gè)生物過程，如在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，前蛋白加工，骨重塑，和細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，也參與多種病理過程，如心血管疾病和炎癥等。因此，半胱氨酸蛋白酶的活性需要被抑制劑嚴(yán)格控制。CST3又稱胱抑素C(Cys C)，是半胱氨酸蛋白酶的一種重要的內(nèi)源性抑制劑[9]，屬于蛋白酶抑制劑的半胱氨酸蛋白酶抑制劑II型超家族，是由Cst3基因編碼、分子量為13 kDa的分泌蛋白。CST3是一種非糖基化堿性蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種體液及組織的有核細(xì)胞中，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的蛋白水解酶，保護(hù)細(xì)胞使其免受細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外蛋白水解酶的水解，是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)組織蛋白酶B抑制作用最強(qiáng)的蛋白酶抑制劑[10]。血清CST3水平具有一定的診斷價(jià)值，是癌癥、心血管疾病和炎性肺病等疾病的預(yù)后標(biāo)志之一[11-12]。當(dāng)腎功能和腎小球?yàn)V過率下降時(shí)，血清CST3水平顯著升高。而循環(huán)中CST3水平降低則與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成有關(guān)。此外，CST3異常表達(dá)也參與腫瘤轉(zhuǎn)移、自身免疫疾病、肝功能障礙和阿爾茲海默癥的淀粉樣蛋白沉積等疾病的發(fā)生發(fā)展[13-16]。人類Cst3基因位于第20號(hào)染色體短臂13區(qū)2上，總長約4.3 kb，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼146個(gè)氨基酸的CST3蛋白。而小鼠CST3蛋白有140個(gè)氨基酸，長爪沙鼠CST3蛋白總長為142個(gè)氨基酸。核酸和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，沙鼠CST3蛋白序列與人、小鼠CST3序列同源性都較低。因此，在進(jìn)一步研究長爪沙鼠CST3基因功能時(shí)，特異性抗體和CST3蛋白不宜使用現(xiàn)有人源性或小鼠源性產(chǎn)品，建立長爪沙鼠CST3蛋白的體外表達(dá)體系十分必要。

Cst3是一個(gè)多態(tài)性非常強(qiáng)的基因，在人類CST3蛋白編碼區(qū)就有223個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)。現(xiàn)有研究表明，多種Cst3基因的SNP位點(diǎn)與糖尿病、肥胖、冠心病、阿爾茲海默癥和代謝綜合征等疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[10,17-20]。在建立長爪沙鼠CST3蛋白體外表達(dá)體系時(shí)，我們克隆的封閉群長爪沙鼠Cst3 CDS區(qū)序列與GeneBank中Cst3 cDNA序列存在一個(gè)堿基的差異，且這一堿基的不同會(huì)導(dǎo)致CST3蛋白質(zhì)序列的一個(gè)氨基酸改變。由核苷酸序列比對(duì)可知，這個(gè)差異堿基位點(diǎn)恰好對(duì)應(yīng)的是人Cst3基因中的一個(gè)SNP位點(diǎn)rs1428071266，這提示長爪沙鼠中的這個(gè)差異位點(diǎn)可能是一個(gè)SNP位點(diǎn)。但是，目前尚無關(guān)于該位點(diǎn)功能的報(bào)道。

我們將密碼子優(yōu)化的CST3蛋白編碼序列插入pET28a蛋白表達(dá)載體中構(gòu)建了重組長爪沙鼠CST3蛋白表達(dá)質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，通過IPTG誘導(dǎo)獲得分子量大約為15 kDa N端攜帶6X His標(biāo)簽的重組長爪沙鼠CST3蛋白。但是誘導(dǎo)后獲得的高效表達(dá)的CST3蛋白主要以包涵體形式存在，普通的鎳柱層析純化方法只能獲得很少的可溶性長爪沙鼠CST3蛋白[21]，不足以進(jìn)行后期抗體制備等實(shí)驗(yàn)。因此，后續(xù)若進(jìn)行蛋白制備，可考慮用變劑溶解，純化復(fù)性后獲得CST3蛋白，以用于抗體制備和進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究對(duì)長爪沙鼠Cst3基因序列同源性進(jìn)行了分析，并成功構(gòu)建了重組CST3蛋白表達(dá)載體，為長爪沙鼠Cst3基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。