李 想 向紹杰 趙 磊 關(guān)敬之 齊 越 孟 莉丁春曉 喬菊久 甘 雨 劉小虎

(1. 遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽 110042)(2. 遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽 110034)(3. 內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院,呼和浩特 010065)

特異性心肌病是指病因明確的心肌疾病,這些病稱為特異性心肌疾病。特異性心肌病，包括缺血性心肌病、高血壓心肌、瓣膜性心肌病、代謝性心肌炎病、癥性心肌病等。缺血性心肌病表現(xiàn)為擴張型心肌病伴收縮功能損傷而不能以冠狀動脈病變或缺血損傷的范圍來解釋[1]。瓣膜性心肌病表現(xiàn)為心室功能障礙而超過了其異常負荷。高血壓性心肌病常表現(xiàn)為左心室肥大伴擴張型和心力衰竭的特點。異丙腎上腺素對β受體有較強的激動作用，過量時因增加心肌收縮力和耗氧量，可引起心律失常甚至心肌缺血壞死[2]。本研究經(jīng)皮下多點注射不同天數(shù)異丙腎上腺素(1 mg/kg)誘發(fā)大鼠特異性心肌病，通過大鼠心肌組織切片HE染色、免疫組化檢測VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、FGF(成纖維細胞生長因子)表達以及心電圖T波的變化確定最佳的造模時間，為后續(xù)藥效學(xué)評價提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

鹽酸異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，批號41160302)。VEGFA Polyclonal Antibody (Elabscience Biotechnology CO.,Ltd,Catalog No:EGM0307)。FGF2 Polyclonal Antibody (Elabscience Biotechnology CO.,Ltd,Catalog No:ESAP12457)。DAB濃縮型試劑盒(Beijing Solarbio Science & Technology CO.,Ltd,20170419)。PBS磷酸緩沖液(Solarbio,20170531)。

1.2 動物

SD大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量l80～200 g，SPF級，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.3 儀器

ML785型多道生理記錄儀，澳大利亞AD公司生產(chǎn)；光電顯微鏡：奧林巴斯中國有限公司生產(chǎn)，BX53型；電熱恒溫培養(yǎng)箱：廈門醫(yī)療電子儀器廠生產(chǎn)，JKDP2型；TP1020自動脫水機，德國(徠卡)生產(chǎn)；YG-280KX攤片機，湖北孝感市陽光神琦醫(yī)用科技有限公司；YG-280KX烤片機，湖北孝感市陽光神琦醫(yī)用科技有限公司；Leica切片機，德國(徠卡)生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1特異性心肌病模型的建立[3-6]

將SD大鼠90 只適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，所有大鼠用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體質(zhì)量)麻醉，測基礎(chǔ)心電圖。剔除心電圖異常大鼠10只，然后抽取80只大鼠隨機分成空白對照組、皮下多點注射異丙腎上腺素(1 mg/kg)2 d組、4 d組、6 d組，每組20只。除空白對照組外各組大鼠腹腔注射異丙腎上腺素(1 mg/kg)[3-7]。分別于皮下多點注射異丙腎上腺素(1 mg/kg·d-1)2 d、4d、6 d后停止注射，于首次注射異丙腎上腺素后第13天在各組存活的大鼠中隨機抽取10只用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，測心電圖，迅速處死大鼠，取下心臟，用4%甲醛溶液固定，取左心室心尖，進行HE染色，并通過免疫組化法檢測心肌血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子在心肌細胞的表達。

1.4.2HE染色心臟病理分級

0級，正常心肌，無病變；1級，局灶性的間質(zhì)反應(yīng)；2級，多處局灶性損害，心室有散在小灶性壞死及條索狀壞死，肌纖維腫脹和斷裂；3級，退行性損害伴隨玻璃樣壞死、肌纖維斷裂以及水腫，部分心肌細胞溶解消失，中性白細胞浸潤，右心室亦有灶性壞死；4級，左心室片狀透壁壞死，心肌細胞溶解消失，肉芽組織增生，呈片狀淋巴細胞、單核細胞及中性白細胞浸潤，右心室亦有灶性壞死。HE積分平均值等于每組大鼠心臟病理分級之和除以每組大鼠動物數(shù)。

1.4.3免疫組織化學(xué)染色

按照DBA試劑盒說明書操作進行免疫組化染色，心肌血管內(nèi)皮生長因子抗體稀釋比例為1∶300，堿性成纖維細胞生長因子抗體稀釋比例為1∶200，觀察左心室心肌細胞的病理變化，并使用ImageJ軟件對免疫組化染色病理切片進行半定量分析，計算相對光密度值(A)。A=log[gv0/gv)](gv0 為背景區(qū)灰度值， gv 為陽性反應(yīng)區(qū)域灰度值)。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件處理，計量資料滿足正態(tài)性和方差齊性者進行方差分析，以P﹤0.05或0.01為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠心電圖T波變化的結(jié)果

注射異丙腎上腺素6 d組與空白對照組T波具有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1 對心電圖T波變化的影響Table 1 Influence of T-wave changes in

注：★與空白對照組比較P<0.05，T波變化：F=4.50。T波變化值=造模前T波值-造模后T波值

Note:★was compared with the blank control groupP<0.05, T- wave change: F=4.50. T-wave change value=pre-modelling T-wave value-post-modelling T-wave value

2.2 大鼠心肌細胞HE染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

注射異丙腎上腺素4 d組、異丙腎上腺素6 d組HE染色積分平均值與空白對照組比，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。異丙腎上腺素4 d組、異丙腎上腺素6 d組VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)表達相對光密度值與空白對照組比較，具有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)。異丙腎上腺素6 d組FGF(成纖維細胞生長因子)表達相對光密度值與空白對照組比，具有顯著性差異(P<0.01)，見表2、圖1、圖2、圖3。

表2 心肌細胞HE染色及免疫組織化學(xué)染色Table 2 HE staining and immunohistochemical staining of myocardial

注：★與空白對照組比較P<0.05，★★與空白對照組比較P<0.01。F=9.53，F(xiàn)=12.72，F(xiàn)=12.64

Note:★Compared with the blank control groupP<0.05,★★Compared with the blank control groupP<0.01. F=9.53，F(xiàn)=12.72，F(xiàn)=12.64

圖1 心肌細胞HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of myocardial cells

圖2 VEGF在心肌細胞中的表達Fig.2 VEGF activity in myocardial cells

圖3 FGF在心肌細胞中的表達Fig.3 FGF activity in myocardial cells

3 討論

T波位于S-T段之后，是心室復(fù)極所產(chǎn)生的，鈍圓，占時較長，從基線緩慢上升，然后較快下降，形成前肢較長、后肢較短的波形。正常T波方向常和QRS波群的主波方向一致。在QRS波群主波向上的導(dǎo)聯(lián)中，T波倒置或低平，常見于心肌缺血[7]。心肌缺血的心電圖改變類型取決于缺血的發(fā)生部位、持續(xù)時間和嚴重程度。具有特異性的心肌缺血發(fā)作時，面向缺血部位的導(dǎo)聯(lián)常顯示缺血型ST段壓低或T波倒置[8]。本研究結(jié)果表明隨著造模時間的延長，T波變化值逐漸變大，造模6 d后T波變化值與空白對照組具有顯著性差異，T波低平或倒置，揭示心肌缺血模型造模成功。

缺血性心肌病指由于長期心肌缺血導(dǎo)致心肌彌漫性纖維化等一系列表現(xiàn)的臨床綜合征，是心肌供氧量不足以滿足心肌的需氧量，使血氧供需失衡引起的一種結(jié)果。異丙腎上腺素對β受體作用較強；過量時因增加心肌收縮力及耗氧量，引起心律失常和心肌缺血壞死。大鼠經(jīng)皮下反復(fù)給予過量的異丙腎上腺素可引起心肌耗氧量增加，從而引起供氧和需氧之間的不平衡導(dǎo)致心肌細胞變性和壞死，進而引起心肌纖維化心肌瘢痕形成。由HE染色可見，正常心肌，無病變，隨著注射異丙腎上腺素時間的增加，心肌細胞損傷程度逐漸加重，注射異丙腎上腺素2 d組可見局灶性的間質(zhì)反應(yīng)；注射異丙腎上腺素4 d組可見多處局灶性損害，心室有散在小灶性壞死及條索狀壞死，肌纖維腫脹和斷裂；注射異丙腎上腺素6 d組出現(xiàn)部分心肌細胞溶解消失，中性白細胞浸潤。

血管內(nèi)皮生長因子通過提高血漿酶原活化因子和血漿酶原活化因子抑制因子-l的mRNA表達，來提高血漿酶原活化因子的活性，能夠促進細胞外蛋白水解，然后促進新生毛細血管的形成[9]。血管內(nèi)皮生長因子可通過細胞小囊泡器增加血管通透性，血管內(nèi)皮生長因子是最強的可增加血管通透性的因子。血管內(nèi)皮生長因子可以誘導(dǎo)血漿蛋白溶酶原激活物和血漿溶酶原激活物抑制劑-1，以及基質(zhì)膠原酶、誘導(dǎo)組織因子等在內(nèi)皮細胞的表達。在動物和成人的正常心肌細胞也有低水平表達，當心肌細胞因缺血缺氧受到損傷時，血管內(nèi)皮生長因子可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生因此表達增加。成纖維細胞生長因子(FGF)在動脈粥樣硬化病灶中促進內(nèi)皮細胞的游走和平滑肌細胞的增殖，還可以促進新血管形成，修復(fù)受損害的內(nèi)皮細胞[10-12]。成纖維細胞生長因子一直被認為是病灶形成促進因子，但其又可加強左心室厚度，增強心肌彈性力，防止在血管壁沉積，治療血栓。因此在心肌細胞受到損傷時，成纖維細胞生長因子表達也會增加。由實驗結(jié)果可知隨著注射異丙腎上腺素天數(shù)延長VEGF和FGF表達也在逐漸增加，注射異丙腎上腺素4 d組、異丙腎上腺素6 d組VEGF表達與空白對照組比較具有顯著性差異。注射異丙腎上腺素6 d組FGF表達與空白對照組比較具有顯著性差異。

本研究結(jié)果表明隨著皮下多點注射異丙腎上腺素時間的延長，大鼠特異性心肌病所引起的心肌缺血更加顯著，表現(xiàn)為心電圖T波低平或倒置，與空白對照組比異丙腎上腺素6 d組HE染色、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、FGF(成纖維細胞生長因子)表達均具有顯著性差異，因此大鼠連續(xù)皮下多點注射異丙腎上腺素(1 mg/kg·d-1)6 d以上可以作為特異性心肌病藥效評價的可靠實驗動物模型使用。