李恒華 施汀蘭 王天文 羅金萍 張 莉 黃文濤

(重慶市中藥研究院，重慶市藥物安全評價中心，重慶 400065)

新藥的安全性評價中，實驗動物組織器官的毒性病理學(xué)檢查是非常重要的檢測項目。SD大鼠因其具有個體差異小，試驗數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，成為國際上生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公認(rèn)的實驗動物[1]，也是常用的進(jìn)行藥物安全性評價研究的嚙齒類實驗動物。由于其自身或外界的影響，常會出現(xiàn)一些自發(fā)性疾病(即實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處理，在自然情況下所發(fā)生的疾病[2])，對病理診斷結(jié)果的判斷產(chǎn)生直接的影響，從而干擾了對藥物引起的組織器官病變的正確評價。因此，了解其重要臟器的自發(fā)病變情況，才能正確評價實驗中出現(xiàn)的病理學(xué)改變，從而得出正確的結(jié)論。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等生命科學(xué)的迅速發(fā)展，對實驗動物質(zhì)量的要求也越來越高。實驗動物的質(zhì)量，直接影響到動物實驗研究結(jié)果的精確性和可重復(fù)性，實驗動物的自發(fā)病變已成為影響動物質(zhì)量和干擾動物實驗結(jié)果的重要因素，對現(xiàn)有飼養(yǎng)條件下自發(fā)病變的調(diào)查和研究，已成為實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化和實驗動物病理監(jiān)測的重要內(nèi)容。

為探討不同飼養(yǎng)環(huán)境下不同周齡以及不同性別SD大鼠自發(fā)病變的異同，并完善SD大鼠自發(fā)疾病的病理學(xué)背景資料，本研究觀察了本中心共計976只空白對照SD大鼠的主要組織器官的自發(fā)性病變的種類及其發(fā)生率，并進(jìn)行了統(tǒng)計和分析，以期為生物醫(yī)學(xué)和藥物的安全性評價研究提供動物臟器自發(fā)性病變的基本資料。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

甲醛(重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；二甲苯(重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；無水乙醇(重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；伊紅(成都瑞琦科技實業(yè)有限責(zé)任公司)；蘇木素(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；鹽酸(重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；組織自動脫水機(jī)，德國徠卡有限公司，型號TP1020；高級智能脫水機(jī)，德國徠卡有限公司，型號ASP300S；生物組織自動包埋機(jī)，湖北泰維醫(yī)療科技有限公司，型號TB-718；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國徠卡有限公司，型號RM2135和RM2235；恒溫攤片烤片機(jī)，湖北泰維醫(yī)療科技有限公司，型號TK-218；生物組織自動染色機(jī)，湖北泰維醫(yī)療科技有限公司，型號TR-180；光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯株式會社，型號CH30和CX31。

1.2 動物

SPF級SD大鼠，總計976只，為近8年內(nèi)藥物安全性評價試驗空白對照組用動物，其中10周齡雌雄SD大鼠總計為112只，19周齡雌雄SD大鼠總計為363只，23周齡雌雄SD大鼠總計為128只，32周齡雌雄SD大鼠總計為228只，36周齡雌雄SD大鼠總計為145只。動物由本院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2007-0006，SCXK(渝)2012-0006。一部分實驗大鼠(總計為650只)飼養(yǎng)于全屏障SPF級動物實驗房內(nèi)(飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%)，喂以大小鼠維持飼料，自由進(jìn)食，飲水為純化水，裝于消毒過的飲水瓶內(nèi)自由飲用。一部分實驗大鼠(總計為326只)飼養(yǎng)于普通級動物實驗房內(nèi)(飼養(yǎng)室溫度19～28 ℃，相對濕度40%～70%)，喂以大小鼠維持飼料，飲水為生活飲用水，自由進(jìn)食進(jìn)水。動物房使用許可證號：SYXK(渝)2007-0003，SYXK(渝)2012-0003。飼料購自北京科澳協(xié)力有限公司。

1.3 方法

安樂死方法處死動物，所有動物處死前禁食不禁水，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，用注射器腹主動脈采血后放血處死后進(jìn)行大體解剖。觀察各臟器的位置、形狀、大小、顏色、軟硬度等，確定是否有異常情況。將下列組織用10% 的中性甲醛溶液固定，供進(jìn)一步組織病理學(xué)檢查：心、肝、肺、腎、脾、腦、脊髓、氣管、主支氣管、食管、胰腺、胃、腸(十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、盲腸)、腎上腺、垂體、甲狀腺(包括甲狀旁腺)、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、眼球、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、卵巢、子宮、乳腺、陰道、膀胱、皮膚、骨骼肌、坐骨神經(jīng)、主動脈、頜下腺等臟器。取固定的組織和器官，經(jīng)常規(guī)脫水后石蠟包埋、切片、HE染色、光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。兩樣本率的比較采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同周齡大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率

在屏障系統(tǒng)和普通環(huán)境的正常飼養(yǎng)條件下，SD大鼠連續(xù)30余周喂養(yǎng)期間，經(jīng)組織病理學(xué)檢查，雌雄大鼠均未出現(xiàn)腫瘤病變。心臟、肝臟、肺、腎臟、胰腺、氣管、主支氣管、前列腺、睪丸、子宮和陰道均發(fā)現(xiàn)了各種類型的非腫瘤病變，其主要病變多為炎性細(xì)胞浸潤，病變程度都較輕，多以點(diǎn)狀、灶狀為主，總體發(fā)病率不高。SD大鼠大腦、小腦、主動脈、食管、甲狀腺、腎上腺、胸腺、小腸、大腸、胃、脾、唾液腺、垂體、骨髓、膀胱、脊髓和卵巢等未發(fā)現(xiàn)明顯自發(fā)病變。

隨著大鼠周齡的增長，在屏障環(huán)境和普通環(huán)境飼養(yǎng)條件下，大鼠常見自發(fā)性病變,病變程度和發(fā)病率大部分均有所增加，在范圍和程度上總體均呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢。提示SD大鼠大部分自發(fā)病變及發(fā)生率可隨周齡增長而增加。受檢臟器的數(shù)量及自發(fā)病變發(fā)生率詳見表1、表2。

2.2 不同性別大鼠自發(fā)病變及發(fā)病率

SD大鼠自發(fā)性病變中，在屏障環(huán)境和普通環(huán)境飼養(yǎng)條件下，少數(shù)病變均呈現(xiàn)較為明顯的性別差異。其中，進(jìn)行性心肌病雌雄差異最為明顯，在兩種環(huán)境下雄性發(fā)病率均遠(yuǎn)高于雌性(P<0.05或P<0.01)，其次為腎臟礦物質(zhì)沉著，在兩種環(huán)境下雌性發(fā)生率均明顯高于雄性(P<0.05)。雄性胰腺萎縮的發(fā)病率也有高于雌性的趨勢。其余病變的性別差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表3、表4。

2.3 不同飼養(yǎng)環(huán)境下大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率

與屏障系統(tǒng)相比較，普通環(huán)境大鼠肺、氣管和主支氣管的自發(fā)病變率明顯升高(P<0.05或P<0.01),其余臟器組織的病理改變兩者間未見明顯差異。詳見表5(主要列出病變發(fā)生率有顯著差異的臟器組織)。

表1 屏障環(huán)境下不同周齡SD大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率(%)Table 1 Spontaneous lesions and incidences of SD rats at different weeks of age under the center barrier(%)

表2 普通環(huán)境下不同周齡SD大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率(%)Table 2 Spontaneous lesions and incidences of SD rats at different weeks of age under the ordinary environment(%)

表3 屏障環(huán)境下不同性別SD大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率(%)Table 3 Spontaneous lesions and incidences of SD rats of different genders under the center barrier (%)

注：*P<0.05，雌vs 雄；**P<0.01：雌vs 雄

Note：*P<0.05female vs male；**P<0.01，female vs male

表4 普通環(huán)境下不同性別SD大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率(%)Table 4 Spontaneous lesions and incidences of SD rats of different genders under the ordinary environment (%)

注：*P<0.05，雌vs 雄

Note：*P<0.05，female vs male

表5 不同飼養(yǎng)環(huán)境下SD大鼠自發(fā)病變及發(fā)生率(%)Table 5 Spontaneous lesions and incidences of SD rats at different weeks of age under different environments(%)

注：*普通環(huán)境vs 屏障環(huán)境，P<0.05；**普通環(huán)境vs 屏障環(huán)境，P<0.01

Note：*the ordinary environment vs the center barrier，P<0.05；**the ordinary environment vs the center barrier，P<0.01

3 討論

在藥物安全性評價中，SD大鼠是應(yīng)用廣泛的實驗動物，明確其背景資料，了解其各組織器官的自發(fā)性病變種類及發(fā)生率對試驗研究具有重要的指導(dǎo)意義。本中心對不同飼養(yǎng)環(huán)境下SD大鼠的主要臟器進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗期間SD大鼠未出現(xiàn)腫瘤病變。心臟、肝臟、肺、腎臟、胰腺、氣管、主支氣管、前列腺、睪丸、子宮和陰道等均見不同程度的病理學(xué)改變。本研究中所觀察到的SD大鼠自發(fā)病變與其他實驗室的報道比較并無特殊的自發(fā)病變[3-6]。

環(huán)境因素主要指空氣質(zhì)量、溫度、濕度等，也包括原因未明的傳染因子。本研究結(jié)果顯示，與屏障系統(tǒng)相比較，普通環(huán)境大鼠肺、氣管和主支氣管的自發(fā)病變率明顯升高(P<0.05或P<0.01),提示實驗環(huán)境主要對SD大鼠呼吸系統(tǒng)的自發(fā)病變具有明顯影響，因此嚴(yán)格控制實驗環(huán)境是降低呼吸道自發(fā)病變發(fā)生率的有效措施，對保證實驗結(jié)果的可靠性具有重要意義，同時本研究結(jié)果也為實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境對動物自身疾病的影響提供了重要依據(jù)。

在進(jìn)行藥物多次給藥毒性評價時，需要區(qū)別組織病理學(xué)檢查所觀察到的病變是染毒相關(guān)的病變還是動物的自發(fā)病變，這主要通過統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗進(jìn)行判斷；與對照組相比，如果高劑量組病變發(fā)生率增高具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，則可考慮病變的發(fā)生與染毒具有相關(guān)性。然而，在每組動物數(shù)不變的情況下，如果對照組動物病變(自發(fā)性病變)發(fā)生率很高，則可降低統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗的效率，掩蓋受試物所引起的病變發(fā)生率的增高，干擾對研究結(jié)果的準(zhǔn)確評價[7]。因此，動物自發(fā)性非腫瘤病變的發(fā)生率對于評價藥物多次給藥毒性試驗結(jié)果具有重要的參考價值，實驗室背景數(shù)據(jù)對判定藥物是否引起常見自發(fā)性疾病的發(fā)生率改變至關(guān)重要。而正常情況下SD大鼠的許多重要組織器官均有不同程度的病理改變，這對生物醫(yī)學(xué)實驗和藥物的安全性評價有重要影響。所以要加強(qiáng)飼養(yǎng)，提高動物質(zhì)量，加強(qiáng)實驗動物自發(fā)病變的病理監(jiān)測，了解常見病變的發(fā)生規(guī)律。同時在藥物安全性評價中，比較給藥組大鼠與對照組大鼠的病理變化時，一定要考慮大鼠的病變是自發(fā)還是受試物本身引發(fā)的[8]，應(yīng)詳細(xì)了解大鼠自發(fā)性病變特點(diǎn)的背景資料，慎重分析，合理評估。

此外，本研究還提示，SD大鼠大部分自發(fā)病變及發(fā)生率隨周齡增長而有增加的趨勢。同時，在SD大鼠自發(fā)性病變中，在屏障環(huán)境和普通環(huán)境飼養(yǎng)條件下，少數(shù)病變均呈現(xiàn)較為明顯的性別差異，其中，以進(jìn)行性心肌病和腎臟礦物質(zhì)沉著最為明顯。這些發(fā)現(xiàn)與以往的研究報道基本一致[7-10]。有研究報道[8]，Wistar大鼠隨周齡增加其進(jìn)行性心肌病的發(fā)病率及病變程度均明顯增加，雄性發(fā)病比雌性早，發(fā)病率高，且病變嚴(yán)重，該結(jié)果與本研究(SD大鼠)十分吻合。本研究中腎臟礦物質(zhì)沉著主要發(fā)生在腎小管內(nèi)，周圍未見明顯的病理性病灶，因此主要考慮為轉(zhuǎn)移性鈣化；該病變雌性發(fā)病率明顯高于雄性，與以往研究結(jié)果一致[9-10]。雌雄病變發(fā)生率差異的具體原因還有待進(jìn)一步研究探討。

目前國內(nèi)鮮有SPF級SD大鼠在正常飼養(yǎng)條件下主要臟器常見病理變化的種類及其發(fā)生率的報道。本研究積累了SD大鼠常見自發(fā)病變的數(shù)據(jù)，作為本實驗室的歷史對照值，為今后建立組織病理學(xué)自發(fā)病變背景數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)，也為有關(guān)技術(shù)人員提供參考，有利于解決準(zhǔn)確判斷正?；虍惓?shù)據(jù)的技術(shù)難題，提高對藥物靶點(diǎn)定位的準(zhǔn)確度。在不同實驗室，大鼠各種自發(fā)性病變的發(fā)生率會有一定差別，這可能與所采用的大鼠的品系、批次、動物飼養(yǎng)環(huán)境條件、動物管理、病理診斷標(biāo)準(zhǔn)等因素有關(guān)。各實驗室有必要充分了解所選用動物自發(fā)疾病的背景資料，并在平時工作中積累實驗數(shù)據(jù)，建立自己實驗室的病理自發(fā)病變數(shù)據(jù)庫，為正確開展和合理評價藥物安全性研究提供基礎(chǔ)[11]。