薛揚(yáng) 劉娜 張苗怡 唐杰 付建輝

腦小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)指各種致病因素累及顱內(nèi)小動(dòng)脈、小靜脈、微動(dòng)脈、微靜脈和毛細(xì)血管所導(dǎo)致的一組臨床疾病[1]，其中以小動(dòng)脈硬化型最常見(jiàn)[2]。目前對(duì)CSVD發(fā)病機(jī)制尚未明了。有研究表明，腦室周?chē)o脈膠原沉積與CSVD中的腦白質(zhì)損害及微梗死有關(guān)[3-5]，可能機(jī)制包括靜脈膠原沉積導(dǎo)致的靜脈管腔狹窄、血循環(huán)壓力增加，血灌注下降，血-腦屏障損害，繼而引起慢性缺血、血管源性水腫等[3，6-7]。流行病學(xué)資料表明，高血壓是小動(dòng)脈硬化型CSVD最主要的危險(xiǎn)因素之一[8]。以往的研究多集中于高血壓對(duì)小動(dòng)脈的影響，針對(duì)小靜脈的病理改變研究較少[9]。本研究擬采用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)模型，探討高血壓對(duì)小動(dòng)脈硬化型CSVD腦小靜脈管壁基質(zhì)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10周齡雄性SHR(高鹽飲食SHR組)及雄性Wistar Kyoto(Wistar Kyoto rat，WKY)大鼠(WKY組)，各6只，來(lái)源于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，給予SHR 10個(gè)月高鹽飲食(1%氯化鈉飲用水及4%高鹽飼料)，給予WKY大鼠10個(gè)月正常飲用水及飼料。大鼠均飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，恒溫22～24℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12h。SHR大鼠體質(zhì)量為360～400g，WKY大鼠體質(zhì)量為380～440g，大鼠合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0006。

1.1.2主要儀器及試劑：冰凍切片機(jī)(CM3050 S，萊卡，德國(guó))、正置熒光顯微鏡(BX53，奧林巴斯，日本)；一抗包括兔源抗α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(1∶500，Sigma，日本)、小鼠來(lái)源抗Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)抗體(1∶1 000，Abcam，英國(guó))、小鼠來(lái)源抗Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ，COLⅣ)抗體(1∶1 000，Abcam，英國(guó))、小鼠來(lái)源抗纖連蛋白抗體(1∶1 000，Abcam，英國(guó))、小鼠來(lái)源抗層黏連蛋白(laminin，LN)抗體(1∶1 000，Abcam，英國(guó))等；熒光標(biāo)記二抗包括Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000，Invitrogen，美國(guó))、Alexa Fluor?555標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，Invitrogen，美國(guó)) 等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織處理：以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，依次經(jīng)心臟灌注等滲鹽水、4%多聚甲醛，斷頭取腦，腦組織固定于4℃ 4%多聚甲醛中過(guò)夜。一半腦組織用于石蠟切片，一半用于冰凍切片，切片選擇層面為前囟前3.0mm(Bregma+3.0mm)，前囟后0.24mm(Bregma-0.24mm)和前囟后3.0mm(Bregma-3.0mm)。參考Bailey等[10]研究方法將腦組織劃分為皮質(zhì)、深部灰質(zhì)、海馬，并進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色：取5μm石蠟切片按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行HE染色[11]，觀察小血管形態(tài)變化。

1.2.3免疫熒光檢測(cè)靜脈膠原沉積：將熒光顯微鏡下α-SMA表達(dá)連續(xù)的視為小動(dòng)脈，α-SMA不表達(dá)或表達(dá)不連續(xù)的視為小靜脈。評(píng)估的小靜脈直徑為20～100μm，除外毛細(xì)血管(5μm)及直徑<20μm的難以檢測(cè)的血管。

取冰凍切片，0.25%聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)破膜15min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1h，抗α-SMA抗體分別與抗COL Ⅰ 抗體、抗COLⅣ抗體、抗纖連蛋白抗體、抗LN抗體混合后4℃孵育切片過(guò)夜，隨后相應(yīng)二抗混合后室溫下孵育1h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)層面的每個(gè)腦區(qū)隨機(jī)拍攝3～5個(gè)視野。使用Image-J軟件(V1.48，National Institutes of Health，美國(guó))進(jìn)行圖像分析。以拍攝圖片的平均熒光強(qiáng)度量化腦小靜脈膠原沉積及各細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的多少。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色血管形態(tài)學(xué)變化

由于飼養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，高鹽飲食SHR組和WKY組均出現(xiàn)2只死亡，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)2組動(dòng)物均為4只。HE染色可見(jiàn)，高鹽飲食SHR小動(dòng)脈血管重構(gòu)，管壁增厚，內(nèi)徑減小，伴隨血管周?chē)g隙增大，符合小動(dòng)脈硬化型CSVD的病理特點(diǎn)(圖1)。

2.2 高鹽飲食SHR與WKY大鼠腦小靜脈膠原沉積及相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)情況整體比較

與WKY組比較，高鹽飲食SHR組腦小靜脈周?chē)酗@著增加的COL Ⅰ 沉積及LN表達(dá)(均P<0.05；圖2，3，表1)；而腦小靜脈周?chē)鶦OLⅣ及纖連蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05；圖4，5，表1)。

表1 高鹽飲食SHR與WKY大鼠腦小靜脈膠原沉積與相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠；COLⅠ為Ⅰ型膠原蛋白，COLⅣ為Ⅳ型膠原蛋白， LN為層黏連蛋白

2.3 兩組不同腦區(qū)膠原沉積及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)比較

2.3.1不同腦區(qū)腦小靜脈COLⅠ沉積比較：與WKY組比較，高鹽飲食SHR組腦皮質(zhì)及深部灰質(zhì)小靜脈COLⅠ沉積顯著增加(均P<0.01)，而海馬區(qū)表達(dá)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈Ⅰ型膠原蛋白沉積水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

2.3.2不同腦區(qū)腦小靜脈COL Ⅳ 沉積比較：高鹽飲食SHR組和WKY組腦皮質(zhì)、深部灰質(zhì)及海馬的小靜脈COL Ⅳ 沉積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表3)。

表3 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈Ⅳ型膠原蛋白沉積水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

2.3.3不同腦區(qū)腦小靜脈纖連蛋白表達(dá)水平比較：與WKY組比較，高鹽飲食SHR組各腦區(qū)的腦小靜脈纖連蛋白沉積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表4 )

2.3.4不同腦區(qū)腦小靜脈LN表達(dá)水平比較：與WKY組比較，高鹽飲食SHR深部灰質(zhì)小靜脈LN表達(dá)顯著增加(P=0.002)，皮質(zhì)和海馬區(qū)小靜脈LN表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表5)。

表4 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈纖連蛋白表達(dá)水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

表5 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈層黏連蛋白表達(dá)水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

3 討論

在以高血壓為主要危險(xiǎn)因素的小動(dòng)脈硬化性CSVD中，腦小動(dòng)脈存在管壁增厚、管壁基質(zhì)增生、血管內(nèi)徑減小等重構(gòu)變化，高血壓在小動(dòng)脈重構(gòu)中起重要作用[12]。為模擬長(zhǎng)期慢性高血壓并加劇SHR大鼠血管重構(gòu)改變，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SHR大鼠給予了長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月的高鹽飲食飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)配合高鹽飲食的高血壓大鼠不僅表現(xiàn)小動(dòng)脈重構(gòu)，其腦小靜脈管壁基質(zhì)也明顯增生。

腦靜脈血管壁基質(zhì)沉積增加最早見(jiàn)于Moody等[3]的報(bào)道，他們通過(guò)對(duì)22例不同年齡死者的尸檢，發(fā)現(xiàn)65%的60歲以上患者存在腦室周?chē)o脈膠原沉積，因而提出“腦室周?chē)o脈膠原病”一詞。Brown等[5]研究發(fā)現(xiàn)，人腦室周?chē)o脈膠原沉積的主要成分是COLⅠ和COLⅢ，而Lin等[4]在雙腎雙夾合并雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄大鼠中發(fā)現(xiàn)，腦小靜脈膠原沉積以COLⅠ和COLⅣ為主。本研究結(jié)果表明，高鹽飲食SHR大鼠腦小靜脈血管壁COL Ⅰ 較WKY組明顯增生，COL Ⅳ與WKY組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Lin等[4]報(bào)道基本一致。高血壓導(dǎo)致的小動(dòng)脈血管壁基質(zhì)增生，不僅表現(xiàn)在膠原增生，還伴隨LN及纖連蛋白等其他血管壁基質(zhì)的改變，并且有報(bào)道指出，LN及纖連蛋白可能在血管壁膠原持續(xù)表達(dá)中起到穩(wěn)定作用[13-14]。因此，本研究同時(shí)還檢測(cè)了腦小靜脈壁LN及纖連蛋白表達(dá)情況，其中高鹽飲食SHR大鼠腦小靜脈LN明顯增生。有研究提示，LN可能參與高血壓帶來(lái)的血流剪切力變化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，高鹽飲食SHR大鼠腦小靜脈LN增生可能進(jìn)一步提示，血流動(dòng)力學(xué)變化在腦小靜脈基質(zhì)增生中可能起到重要作用[15]。

目前對(duì)于腦靜脈血管壁基質(zhì)增生的報(bào)道多見(jiàn)于腦室周白質(zhì)腦靜脈，本研究結(jié)果表明，高鹽飲食SHR大鼠深部灰質(zhì)亦存在明顯的COLⅠ及LN增生，提示長(zhǎng)期慢性高血壓下不僅白質(zhì)小靜脈受累，腦灰質(zhì)小靜脈也存在血管壁基質(zhì)增生。

值得注意的是，有報(bào)道指出，嚙齒類(lèi)動(dòng)物皮質(zhì)小靜脈數(shù)目遠(yuǎn)多于小動(dòng)脈[16]，而人腦皮質(zhì)小靜脈數(shù)目遠(yuǎn)少于小動(dòng)脈，加之在病理研究中，對(duì)于小動(dòng)脈及小靜脈的區(qū)分鑒別方法尚不成熟[4]，可能在一定程度上減少了對(duì)人腦灰質(zhì)小靜脈血管壁基質(zhì)增生的報(bào)道。同時(shí)有研究者推測(cè)，由于在人腦皮質(zhì)中單支小靜脈負(fù)責(zé)引流多支小動(dòng)脈，因此皮質(zhì)小靜脈受累時(shí)可能同時(shí)波及多支小動(dòng)脈供應(yīng)腦區(qū)[16]，因此皮質(zhì)小靜脈形態(tài)及功能可能是腦血管病中一道重要關(guān)口。既往研究顯示，長(zhǎng)期高血壓導(dǎo)致小動(dòng)脈硬化過(guò)程中，小動(dòng)脈α-SMA表達(dá)下降[4]。本研究中高鹽飲食SHR大鼠為10月齡，其小動(dòng)脈α-SMA表達(dá)下降可能更明顯，此外， 我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中所取層面白質(zhì)區(qū)占解剖區(qū)域較小，因此未能捕捉到腦白質(zhì)區(qū)α-SMA明顯表達(dá)以鑒別小動(dòng)脈及小靜脈，后期未選取白質(zhì)區(qū)觀察小靜脈管壁基質(zhì)改變。目前已有研究提示，白質(zhì)靜脈病變可能在皮質(zhì)下微梗死中起重要作用[17]，而人腦灰質(zhì)小靜脈病變情況及其是否與皮質(zhì)微梗死有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

小靜脈血管壁基質(zhì)增生的機(jī)制可能與上游小動(dòng)脈病變后低灌注引起的氧化應(yīng)激相關(guān)[18]，也可能與上游小動(dòng)脈硬化導(dǎo)致下游小靜脈血流動(dòng)力學(xué)改變進(jìn)而引起的生物力學(xué)反應(yīng)有關(guān)[19]，而小靜脈血管壁基質(zhì)增生導(dǎo)致的引流不暢進(jìn)一步加重動(dòng)脈病變，形成惡性循環(huán)。因此未來(lái)研究需關(guān)注于腦小靜脈血管壁基質(zhì)增生的機(jī)制及其是否參與CSVD發(fā)病機(jī)制中。