陳菁，劉旭，楊碩，羅光偉

（武漢市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢 430022）

肺癌在男性惡性腫瘤中位居發(fā)病率和死亡率第一位，在女性中其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢［1］。近年來雖然肺癌治療取得了較大進展，但仍存在早期診斷困難、治療效果差等問題，仍是病死率最高的腫瘤。世界衛(wèi)生組織將肺癌分為4種主要病理類型，分別為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌。前三者通常統(tǒng)稱為非小細(xì)胞肺癌，占所有肺癌的85%，是威脅肺癌患者生存的主要組織類型，其中又以腺癌和鱗狀細(xì)胞癌常見。不同類型的肺癌治療手段差別顯著，因此對肺癌進行正確的組織學(xué)和分子病理學(xué)分型是獲得正確治療的重要前提［2-3］。

經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù) （transbronchial needle aspiration，TBNA） 或支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下的TBNA是一種新型肺癌診斷手段，其對肺癌診斷的敏感度達(dá)90%，特異度達(dá)100%。與PET-CT相比，TBNA具有更高的敏感度和特異度，已被寫入2011年國際肺癌研究協(xié)會/美國胸科學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會的肺癌診治指南［4］。對TBNA獲得的標(biāo)本一般進行基于形態(tài)學(xué)的HE染色，判斷腫瘤的發(fā)生，但進一步判定病理分型則存在諸多限制，如細(xì)胞量少、分化程度低等。對肺癌病理組織標(biāo)本進行分子病理學(xué)檢測，根據(jù)已知公認(rèn)的分型標(biāo)志物進行檢測，可準(zhǔn)確地做出病理分型診斷。研究［5-6］顯示，肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌幾乎不重疊共表達(dá)甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1 （thyroid transcription factor-1，TTF-1） 和p63；細(xì)胞角蛋白 （cytokeratin，CK）5和CK6是鱗狀細(xì)胞癌的特異性標(biāo)志物［7］；CK7是腺癌的特異性標(biāo)志物［8］。目前上述指標(biāo)相關(guān)檢測常在術(shù)后切除病理組織上進行，不利于早期制定治療方案，亦不適用于不宜手術(shù)的患者。因此，若能結(jié)合應(yīng)用TBNA與病理分型分子標(biāo)志物檢測，則能很好解決2種診斷方法的不足。

本研究回顧性研究了TBNA獲得的肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌患者病理組織標(biāo)本，通過實時PCR檢測TTF-1、p63、CK5、CK7等標(biāo)志物的表達(dá)水平，以評價各指標(biāo)診斷肺癌病理分型的價值和準(zhǔn)確性，并探究聯(lián)合應(yīng)用4種標(biāo)志物進行綜合診斷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例樣本

回顧性選取2015年7月至2016年12月間術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為肺癌的患者178例，其中男143例，女35例，平均年齡53.2 （35～77） 歲；組織學(xué)類型：鱗狀細(xì)胞癌120例，腺癌58例。

1.2 組織樣本的獲得及總RNA的提取

首先經(jīng)增強CT掃描等影像學(xué)檢查，或在超聲實時引導(dǎo)下，獲得病變部位的準(zhǔn)確定位信息。在支氣管鏡輔助下進行TBNA操作，利用特制的帶有可彎曲導(dǎo)管的穿刺針 （專利號201720265388.7），通過氣管鏡的活檢通道進入氣管內(nèi)，對縱隔內(nèi)腫大的淋巴結(jié)或腫塊進行穿刺，負(fù)壓抽吸獲取細(xì)胞及組織樣本。在送檢病理科后，留取剩余樣本收集于細(xì)胞凍存管中，盡快放入液氮中保存待用。

待病理組織樣本收集齊備，選取目標(biāo)病理組織進行常規(guī)TRIZOL （美國Invitrogen公司） 提取RNA操作，并經(jīng)紫外分光光度法定量，統(tǒng)一各病例RNA樣本濃度后，進行下一步檢測。

1.3 實時PCR檢測TTF-1、p63、CK7、CK5的表達(dá)水平

取上述提取的定量后總RNA，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 （美國Invitrogen公司） 的作用下，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以該cDNA產(chǎn)物為模板進行實時PCR檢測。目的基因的引物序列：TTF-1，正義5’-CGTTCTCAG TGTCTGACATCTTGA-3’，反義5’-CCTCCATGCCCA CTTTCTTG-3’；p63，正義5’-GGAAAACAATGCCCA GACTC-3’，反義5’-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3’；CK7，正義5’-GTTCCATTTGCAAAGGCTGT-3’，反義5’-CAGGTGGTTACCCGAAAGA-3’；CK5，正義5’-A TCGCCACTTACCGCAAGCTGCTGGAGGG-3’，反義5’-AAACACTGCTTGTGACAACAGAG-3’；GAPDH，正 義5’-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3’，反 義5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，應(yīng)用2-ΔΔCt法進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。各標(biāo)志物基因表達(dá)水平用±s表示；基因表達(dá)水平組間比較采用獨立樣本t檢驗；基因表達(dá)水平與病理分型的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；變量對病理分型的診斷價值采用受試者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線法進行分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌病理分型分子標(biāo)志物表達(dá)水平

實時PCR檢測TTF-1、p63、CK7、CK5的表達(dá)水平。腺癌中各分子標(biāo)志物的表達(dá)水平：TTF-1為1.732±0.243，p63為0.110±0.003，CK7為1.221±0.141，CK5為0.215±0.030；鱗狀細(xì)胞癌中各分子標(biāo)志物的表達(dá)水平：TF-1為0.107±0.004，p63為1.676±0.220，CK7為0.105±0.012，CK5為1.533±0.102。與腺癌相比，鱗狀細(xì)胞癌中TTF-1 （P = 0.006）、CK7 （P = 0.012） 的表達(dá)水平顯著降低，p63 （P = 0.008）、CK5 （P = 0.025）的表達(dá)水平顯著升高。

2.2 建立多因素綜合評分（total score，TS）診斷模型

采用Pearson相關(guān)分析確定各分子標(biāo)志物基因表達(dá)水平與分型的相關(guān)性 （表1）?；诟骰虮磉_(dá)水平與肺癌病理分型的相關(guān)系數(shù) （r），建立TS診斷模型：TS=-0.672×TTF-1+0.778×p63-0.583×CK7+0.604×CK5，TS值越大則病理分型越傾向于鱗狀細(xì)胞癌，TS值越小則病理分型越傾向于腺癌。

2.3 ROC曲線分析各指標(biāo)診斷肺癌病理分型的價值

采用ROC曲線分析4種分型標(biāo)志物與綜合指標(biāo)TS對肺癌病理分型的診斷價值 （圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTF-1、p63、CK7、CK5表達(dá)水平診斷肺癌分型均有良好價值，但運用4個指標(biāo)獲得的綜合指標(biāo)TS進行病理分型診斷時，則最佳分界值的靈敏度 （0.942）和特異度 （0.841） 均最高，ROC曲線下面積亦最大（0.934），診斷價值最佳。

表1 分型標(biāo)志物表達(dá)水平與肺癌病理分型的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation between the expression of typing markers and the pathological typing of lung cancer

2.4 單因素和多因素診斷肺癌病理分型的準(zhǔn)確性比較

圖1 ROC曲線分析各指標(biāo)單獨及綜合應(yīng)用判定肺癌病理分型的價值Fig.1 Diagnostic value of each marker alone or in combination for the pathological typing of lung cancer，as determined by ROC curve analysis

分析4種分型標(biāo)志物及綜合指標(biāo)TS對肺癌病理分型的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺癌檢出率最高的單因素指標(biāo)為TTF-1 （45/88），鱗狀細(xì)胞癌檢出率最高的單因素指標(biāo)為p63 （94/120），總檢出率最高的單因素指標(biāo)為p63 （76.4%）。采用χ2檢驗比較單一指標(biāo)與綜合指標(biāo)檢出率的情況，TS的腺癌檢出率 （P =0.040）、鱗狀細(xì)胞癌檢出率 （P = 0.013） 及總檢出率（P < 0.001） 均顯著升高。見表2。

3 討論

大部分肺癌患者在診斷時已無手術(shù)機會，需要全身化療。越來越多的證據(jù)表明，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌治療反應(yīng)明顯不同，這就推動了非小細(xì)胞肺癌精確的病理分型。如貝伐單抗禁用于鱗狀細(xì)胞癌，這種藥物增加鱗狀細(xì)胞癌患者的肺出血風(fēng)險［9］。因此，肺癌分型已經(jīng)成為治療的關(guān)鍵，并能夠指導(dǎo)個性化治療。對于無法獲得手術(shù)切除標(biāo)本的患者，通過TBNA獲取病理組織則是解決病理分型問題的重要手段。而如何充分利用TBNA獲取的小標(biāo)本進行分型診斷，則具有重要臨床意義。

表2 不同分型指標(biāo)進行肺癌病理分型的檢出率比較Tab.2 Comparison of the accuracy of pathological typing of lung cancer with different markers

本研究選擇了TTF-1、p63、CK7、CK5等肺癌分型常見標(biāo)志物，通過敏感度高、對樣本量要求小的實時PCR法［10］進行檢測，考察單因素和多因素診斷腺癌或者鱗狀細(xì)胞癌的價值。TTF-1是診斷肺腺癌敏感度較高的檢測因子，盡管在其他腫瘤也有表達(dá)，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，但是都沒有在肺腺癌中表達(dá)顯著。p63是p53家族的新成員，與多種復(fù)層上皮原發(fā)性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在肺癌中主要在鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)呈陽性。CK是細(xì)胞骨架的成份之一，其中相對分子量較高的CK5、CK6主要表達(dá)在鱗狀上皮細(xì)胞及其腫瘤組織中，而相對分子量低的CK7則表達(dá)在腺上皮細(xì)胞及其腫瘤組織中。

與已有研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中TTF-1、CK7表達(dá)水平顯著增高，肺鱗癌組織中p63、CK5表達(dá)水平顯著增高。本研究應(yīng)用Pe arson相關(guān)性分析，確立了各指標(biāo)與肺癌分型的相關(guān)系數(shù)，建立綜合4種標(biāo)志物的多因素綜合評分診斷模型TS。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，相對于單因素診斷效果，多因素的TS具有更高的靈敏度和特異度。并且在對比診斷病理分型的準(zhǔn)確性時，TS結(jié)果最好，總體檢出率達(dá)到90.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各個單因素的診斷準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，利用TBNA獲取肺癌患者病理組織，并基于實時PCR法進行肺癌分型重要分子標(biāo)志物TTF-1、p63、CK7、CK5等的表達(dá)水平檢測，是可行的病理診斷方法。且綜合運用各分型指標(biāo)進行診斷能夠獲得更高的診斷效率，這為肺癌病理分型診斷提供了新的檢測思路。