宋君紅，沈樹(shù)紅

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液科，上海 200127）

SH3 域結(jié)合谷氨酸豐富蛋白樣蛋白3 （SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3，SH3BGRL3） 是硫氧還蛋白超基因家族的成員，基因定位于1p34.3-p35，編碼93個(gè)氨基酸。它編碼的蛋白和大腸桿菌的谷氧還蛋白 （glutaredoxin，GRX） 1很相似，是一類小型氧化還原酶。但SH3BGRL3缺乏GRX酶2個(gè)半胱氨酸殘基組成的CXXC活性結(jié)構(gòu)域，所以缺乏GRX酶活性。另外有研究［1］認(rèn)為SH3BGRL3蛋白可能參與抑制腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，所以又被叫做TNF抑制蛋白 （TIP-B1）。近期有研究［2］發(fā)現(xiàn)SH3BGRL3也是一種新的表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合伙伴，但對(duì)其確切功能知之甚少。本課題組前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，SH3BGRL3基因及蛋白在全反式維甲酸 （all-trans retinoic acid，ATRA） 誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病 （acute promyelocytic leukemia，APL） 細(xì)胞株NB4分化過(guò)程中明顯上調(diào)，而SH3BGRL3在急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60中也可被ATRA誘導(dǎo)上調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)SH3BGRL3基因高表達(dá)與ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化成熟有關(guān)。為進(jìn)一步探討NB4細(xì)胞分化與SH3BGRL3基因表達(dá)之間的關(guān)系，本研究應(yīng)用含SH3BGRL3基因的慢病毒質(zhì)粒感染NB4細(xì)胞，使NB4細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SH3BGRL3基因，觀察過(guò)表達(dá)SH3BGRL3后NB4細(xì)胞在ATRA作用下分化行為的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝系統(tǒng)由pLV-CXIH、psPAX2和pMD2.G這3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成，其中pLV-CXIH為過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)移載體，而psPAX2和pMD2.G則含有病毒包裝所必須的其他元件。大腸桿菌感受態(tài)DH5 α為本實(shí)驗(yàn)室保存；攜帶SH3BGRL3基因的質(zhì)粒pSG5-M-SH3BGRL3-FLAG由本課題組前期構(gòu)建完成；APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞及293T細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA 連接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogene公司；質(zhì)粒小抽試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；CD11b、CD54、SH3BGRL3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；CCK-8購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達(dá)載體pLV-CXIH-SH3BGRL3的構(gòu)建與鑒定：以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的含有目的基因的克隆質(zhì)粒pSG5-M-SH3BGRL3-FLAG為模板，用高保真酶體系擴(kuò)增目的基因。PCR產(chǎn)物切膠純化回收，片段長(zhǎng)度280 bp?；厥债a(chǎn)物用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，同時(shí)雙酶切慢病毒載體質(zhì)粒pLV-CXIH，并切膠純化回收，片段長(zhǎng)度8 060 bp。2種膠回收產(chǎn)物用T4連接酶連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，于LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，送中國(guó)Invitrogene公司測(cè)序，確定插入序列正確。

1.2.2 慢病毒質(zhì)粒包裝：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞，2×106/皿，種于10 cm平皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染體系如下：pLV-CXIH-SH3BGRL3 15 μg、psPAX2 10 μg、pMD2.G 5 μg，溶解于TE緩沖液，濃度為0.4～1 μg/μL。轉(zhuǎn)染操作參照磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)。16 h后更換培養(yǎng)液，換液后48 h收集病毒上清，于冰上短期保存。空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同上。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于6孔板中，分別加入6μg/mL的聚凝胺和1 mL包含有慢病毒載體的培養(yǎng)上清，900 g離心2 h，然后去除上清，重懸于1 mL完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每天重復(fù)以上操作1次，轉(zhuǎn)染3～4 d后加Hygromycin B篩選。置于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

1.2.4 Western blotting鑒定：提取轉(zhuǎn)染SH3BGRL3（NB4-SH3） 和轉(zhuǎn)染病毒空載的 （NB4-blank） 的2組NB4細(xì)胞及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的NB4細(xì)胞蛋白作為空白對(duì)照，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，上樣量20 μg，濕式轉(zhuǎn)膜，鼠抗人SH3BGRL3單克隆抗體檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)染情況。

1.2.5 采用CCK-8檢測(cè)過(guò)表達(dá)SH3BGRL3對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NB4-blank、NB4-SH3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，密度為 （2.0～2.5） ×104/孔，分為給藥組和不給藥組。給藥組加入ATRA （終濃度1 μmol/L），孵育12、24、36、48、60及72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL孵育4～5 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量450 nm處各孔的吸光度值。放入培養(yǎng)箱中孵育到上述各相應(yīng)時(shí)間段。

1.2.6 過(guò)表達(dá)SH3BGRL3對(duì)NB4細(xì)胞分化的影響：將NB4-blank、NB4-SH3細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，分為給藥組和不給藥組。給藥組加入ATRA （終濃度1 μmol/L）。培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞CD11b、CD54的表達(dá)情況，并用瑞士-吉姆薩染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建SH3BGRL3過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞后Western blotting檢測(cè)結(jié)果

SH3BGRL3慢病毒載體轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞后，Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SH3BGRL3基因后NB4-SH3細(xì)胞SH3BGRL3蛋白的表達(dá)明顯增高，見(jiàn)圖1。

圖1 構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SH3BGRL3的NB4細(xì)胞株Fig.1 Establishment of NB4 cells with stable overexpression of SH3BGRL3

2.2 SH3BGRL3基因?qū)B4細(xì)胞增殖的影響

不給藥狀態(tài)下NB4-SH3組細(xì)胞的增殖較NB4-blank組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而ATRA處理后，NB4-SH3+ATRA組細(xì)胞的增殖較NB4-blank+ATRA組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)染SH3BGRL3后對(duì)細(xì)胞分化的影響

圖2 過(guò)表達(dá)SH3BGRL3基因抑制NB4細(xì)胞增殖Fig.2 NB4 cell proliferation was significantly inhibited by overexpression of SH3BGRL3

NB4-SH3和NB4-blank細(xì)胞經(jīng)ATRA處理48 h后，NB4-SH3細(xì)胞較對(duì)照NB4-blank細(xì)胞形態(tài)上趨于成熟 （圖3）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATRA處理72 h后，NB4-SH3+ATRA組細(xì)胞CD11b、CD54的表達(dá)較NB4-blank+ATRA組增加，其中CD54的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05） ，見(jiàn)圖4。

圖3 NB4細(xì)胞過(guò)表達(dá)SH3BGRL3后經(jīng)ATRA處理48 h后的形態(tài)變化 ×1 000Fig.3 Morphological changes of NB4-SH3 and NB4-blank cells treated with ATRA for 48 h ×1 000

圖4 NB4-SH3和NB4-blank細(xì)胞經(jīng)ATRA處理72 h后CD11b和CD54陽(yáng)性率的比較Fig.4 Changes in CD11b and CD54 expression in NB4-blank and NB4-SH3 cells treated with ATRA for 72 h

3 討論

APL約占所有急性非淋巴細(xì)胞白血病病例的10%左右，95%以上的APL患者的白血病細(xì)胞中均含有特異的染色體易位t （15；17） （q22；q12），形成融合基因PML-RAR α與RAR α-PML，通過(guò)與維甲酸X受體 （retinoic acid X receptor，RXR） 及其他RAR α輔因子形成多聚復(fù)合體，競(jìng)爭(zhēng)性抑制正常RAR α基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而阻遏髓系分化必需的一些基因的轉(zhuǎn)錄，并抑制細(xì)胞凋亡，造成骨髓中大量未成熟的早幼粒細(xì)胞增生［4-5］。

ATRA在藥理濃度 （10-6～10-7mol/L） 下能使PML-RAR α與核受體共抑制因子N-CoR解離，釋放轉(zhuǎn)錄抑制作用，促進(jìn)維甲酸反應(yīng)基因包括多種癌基因、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子等靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究［6］發(fā)現(xiàn)，APL細(xì)胞受維甲酸調(diào)變的基因多達(dá)169種，包括100種上調(diào)基因及69種下調(diào)基因。通過(guò)龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)減少APL細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，最終促進(jìn)粒細(xì)胞分化成熟。

在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞株NB4分化成熟的過(guò)程中，SH3BGRL3是早期調(diào)變的基因。先期的研究發(fā)現(xiàn)，其mRNA水平在ATRA處理12 h后達(dá)到峰值，蛋白水平在24 h達(dá)到峰值。SH3BGRL3是一種胞質(zhì)蛋白，在NB4及多種正常組織中都有表達(dá)。目前對(duì)其功能知之甚少。一般認(rèn)為，ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞12 h內(nèi)發(fā)生調(diào)變的基因?qū)?dòng)NB4細(xì)胞分化作用更重要。而SH3BGRL3基因調(diào)變與NB4細(xì)胞分化趨勢(shì)一致，所以本研究通過(guò)NB4細(xì)胞過(guò)表達(dá)SH3BGRL3基因，研究NB4-SH3的功能變化，以了解SH3BGRL3基因在NB4細(xì)胞增殖及分化成熟中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖方面NB4-SH3細(xì)胞增殖較NB4細(xì)胞降低，ATRA處理后這種增殖抑制效果更明顯。通過(guò)細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，SH3BGRL3增加周期的阻滯功能。細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SH3BGRL3后NB4細(xì)胞形態(tài)趨于成熟，通過(guò)細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)到NB4細(xì)胞表面成熟粒細(xì)胞免疫標(biāo)記CD11b表達(dá)增加，也證實(shí)了這一點(diǎn)。

NB4細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)成熟后引起一系列細(xì)胞表 面 抗 原 變 化，包 括CD11c、CD54、CD11a、CD14、CD11b、CD53、CD65、CD138等，這些抗原的變化可以作為APL治療性抗體的選擇。本研究發(fā)現(xiàn)，NB4-SH3細(xì)胞較對(duì)照NB4細(xì)胞CD54、CD11b的表達(dá)無(wú)明顯增高，但經(jīng)ATRA處理后，CD54、CD11b的表達(dá)增加。所以認(rèn)為SH3BGRL3的表達(dá)能促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞成熟，考慮SH3BGRL3通過(guò)作用于其他伙伴基因共同促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞分化成熟。ATRA治療過(guò)程中約30%的APL患者可能出現(xiàn)維甲酸綜合征，其原因?yàn)檎T導(dǎo)分化后的細(xì)胞通過(guò)改變黏附分子和細(xì)胞趨化因子引起細(xì)胞及鄰近細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致［7］。CD54分子 （ICAM-1） 在APL細(xì)胞表達(dá)低下，而ATRA和三氧化二砷能明顯誘導(dǎo)APL細(xì)胞及肺臟血管上皮CD54的表達(dá)。考慮CD54可能參與介導(dǎo)了腫瘤與基質(zhì)的黏附，從而與維甲酸綜合征的發(fā)生有關(guān)［8］。

造血細(xì)胞的分化需要啟動(dòng)不同轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞膜蛋白及細(xì)胞因子等基因的活性，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡，并伴隨細(xì)胞膜蛋白及細(xì)胞因子的變化，而這些蛋白及細(xì)胞因子的表達(dá)提供了有關(guān)預(yù)后的信息。研究發(fā)現(xiàn)，APL細(xì)胞中如果伴有TNF-α、白細(xì)胞介素-1等能提高ATRA對(duì)APL患者的治療敏感性，有利于APL細(xì)胞的分化成熟。TNF-α能下調(diào)細(xì)胞的數(shù)量，并且參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及存活。有研究［1］發(fā)現(xiàn)，SH3BGRL3能激活核因子-κ B信號(hào)通路，抑制TNF-α介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的凋亡。而在ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中C-fos、C-jun表達(dá)增高，與核因子-κ B相關(guān)基因開(kāi)啟有關(guān)。所以SH3BGRL3是否通過(guò)抑制TNF-α信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)或增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞的分化成熟，有待進(jìn)一步研究。