黎歡 胡益 姚旭 吳淋蓉 沈毅

[摘要] 鼓膜穿孔是耳鼻喉科常見(jiàn)的臨床癥狀，慢性鼓膜穿孔治療主要通過(guò)手術(shù)修補(bǔ)，各種自體移植材料常被作為移植物來(lái)修補(bǔ)穿孔鼓膜。近年來(lái)，鼓膜再生領(lǐng)域的研究逐漸趨向于應(yīng)用組織工程學(xué)治療技術(shù)。許多新型組織工程材料在鼓膜修復(fù)中體現(xiàn)出良好的鼓膜再生和聽(tīng)力重建效果。然而，組織工程鼓膜的制作需要考慮多種因素。本綜述通過(guò)總結(jié)概括目前在鼓膜穿孔修復(fù)中所使用的支架材料、生物活性分子和細(xì)胞來(lái)闡述鼓膜再生的組織工程學(xué)研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 鼓膜穿孔;組織工程學(xué);支架;生物活性分子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R764 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）08-0164-05

[Abstract] Tympanic membrane（TM） perforation is a common clinical symptom in the department of otolaryngology. Presently， chronic TM perforation is mainly treated by surgery， with various graft materials （e.g. autologous cartilage and fascia） being used as patches to repair TM perforations. Resent research in the field of TM regeneration tends to the tissue engineering techniques. These tissue-engineered materials have showed good results in perforation closure and acoustic function reconstruction. However， various factors need to be considered in the manufacture of bio-engineered TM. This review describes the advances in research of TM tissue engineering by summarizing the scaffold materials， bioactive molecules （BMs） and cells currently used for TM wound healing.

[Key words] Tympanic membrane perforation; Tissue engineering; Scaffold; Bioactive molecule

鼓膜穿孔是耳科常見(jiàn)癥狀，多由慢性化膿性中耳炎或耳外傷所致。慢性鼓膜穿孔會(huì)導(dǎo)致聽(tīng)力下降、反復(fù)中耳感染和膽脂瘤[1]。慢性化膿性中耳炎引起的鼓膜穿孔甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的顱內(nèi)外并發(fā)癥[2]。目前治療慢性穿孔的方法通常是實(shí)施鼓膜修補(bǔ)手術(shù)，運(yùn)用各種自體組織（包括顳肌筋膜、軟骨、脂肪、軟骨膜）來(lái)修補(bǔ)穿孔鼓膜。盡管這些材料有一定效果，但都有其局限性。自體移植會(huì)損傷自身組織，并且在二次手術(shù)時(shí)取材受限。另一方面，同種異體移植物和異種移植物具有潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)[3]。更重要的是，這些移植物均不能復(fù)制出原始鼓膜復(fù)雜的精細(xì)結(jié)構(gòu)和聲學(xué)振動(dòng)特性[4]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)材料學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，我們看到了從簡(jiǎn)單鼓膜移植物到組織工程人工鼓膜的演變。組織工程鼓膜的出現(xiàn)在鼓膜的修復(fù)治療中具有變革意義。

1 鼓膜組織工程學(xué)概念

組織工程學(xué)是通過(guò)體內(nèi)或體外的方式實(shí)現(xiàn)：體內(nèi)途徑是在組織培養(yǎng)或者生物反應(yīng)器中重建器官，包括細(xì)胞和支架材料，而體外方法則是用非細(xì)胞支架的生物材料，擁有有助于細(xì)胞募集和分化的生物特性[5]。組織工程中三大重要的元素是支架材料、生物活性分子和細(xì)胞。支架材料為細(xì)胞增殖、遷移提供機(jī)械支撐，生物活性分子（bioactive molecules，BMs）則為細(xì)胞分化提供適宜的生化微環(huán)境。重要的是，這個(gè)工程的創(chuàng)建應(yīng)該相互作用，在組織生長(zhǎng)的開(kāi)始和維持中要有動(dòng)態(tài)交互性[6]。運(yùn)用組織工程學(xué)概念進(jìn)行鼓膜再生，可以為鼓膜穿孔提供更優(yōu)的治療方法。

2 支架材料

2.1 脫細(xì)胞組織

脫細(xì)胞組織支架（同種異基因或異種）去除了細(xì)胞成分而保留大部分原來(lái)細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性和機(jī)械特性。這些支架最主要的優(yōu)點(diǎn)是在微結(jié)構(gòu)、成分和生物化學(xué)特性上與原組織的細(xì)胞外基質(zhì)非常接近，然而，不同的供體組織也會(huì)有不同的變化。例如，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）是由人類(lèi)同種異基因供體組織加工而成的，是一種冷凍干燥的脫細(xì)胞的真皮內(nèi)基質(zhì)和防腐的基底膜組成[7]。當(dāng)ADM用于治療鼓膜穿孔時(shí)，它在組織學(xué)上常顯示炎癥反應(yīng)帶，伴隨大量成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮增生和新生血管形成[8，9]。近期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，在豚鼠模型中使用同種異體皮膚脫細(xì)胞支架材料修復(fù)鼓膜穿孔是安全有效的[10]。并且臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該材料能較易融入新生組織中且不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)，鼓膜修復(fù)效果理想[11]。其他脫細(xì)胞支架材料包括豬小腸黏膜脫細(xì)胞基質(zhì)（SurgisisR）、豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（urinary bladder matrix，UBM）、豬軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（decellularized extracellular cartilage matrices，DECM）等[12-14]。SurgisisR是一種脫細(xì)胞豬小腸黏膜下基質(zhì)，由膠原蛋白、纖連蛋白和糖胺聚糖組成，已被證實(shí)可促進(jìn)鼓膜再生，但會(huì)導(dǎo)致明顯的炎癥反應(yīng)和材料殘余[12]。UBM由膀胱基質(zhì)脫細(xì)胞后的黏膜層和固有層組成，可提供一個(gè)完整的可供上皮移行的基膜支架。UBM補(bǔ)片較易與鼓膜組織相融且吸收完全，最終使再生的鼓膜具有正常的三層超微結(jié)構(gòu)[13]。DECM支架在最新的體外研究中證實(shí)，在體外常壓和負(fù)壓下，其聲學(xué)振動(dòng)特性在一定程度上與人鼓膜非常接近，可提供振動(dòng)特性和高效聲透射的重要聲學(xué)要求，故DECM為鼓膜聲學(xué)傳導(dǎo)功能的重建提供了一個(gè)選擇，但其在人體內(nèi)的聲學(xué)傳導(dǎo)特性還需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[14]。

2.2 多聚物

多聚物是比較理想的支架材料，因其具有有效性、生物相容性、生物可降解性、易操控性和規(guī)?；a(chǎn)潛能等優(yōu)點(diǎn)[15]。自然多聚物目前正在作為鼓膜穿孔修復(fù)的潛在自然支架被研究和應(yīng)用，包括明膠海綿、絲素蛋白、殼聚糖、藻酸鹽和透明質(zhì)酸等[3]。（1）明膠海綿：來(lái)源于變性的豬皮膚，被廣泛地用作中耳填塞材料以支撐移植的鼓膜和聽(tīng)骨[16]。明膠海綿也被用于修補(bǔ)鼓膜穿孔[17]，其無(wú)毒，具有良好的生物相容性，易于操作，且能夠促進(jìn)止血;（2）絲素蛋白：通常來(lái)源于蠶絲，去除蠶絲外層抗原蛋白后，絲素蛋白被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖和遷移，其中包括人鼓膜角質(zhì)上皮細(xì)胞[18，19]，并可為鼓膜再生提供結(jié)構(gòu)支撐;（3）殼聚糖：是甲殼素氮乙酰衍生物，見(jiàn)于自然界中形成甲殼類(lèi)和昆蟲(chóng)類(lèi)支撐結(jié)構(gòu)的黏多糖[20]。殼聚糖有抗菌特性，且被證實(shí)具有可改善皮膚、骨和肝臟創(chuàng)傷愈合的作用，三維殼聚糖支架材料被證實(shí)可在內(nèi)植法鼓膜成形術(shù)中與再生鼓膜融合[21];（4）藻酸鹽：是一種來(lái)源于海藻的自然有機(jī)多聚物，當(dāng)與鈣交聯(lián)后可提升該材料的可操作性。藻酸鈣移植物作為支架可供黏膜上皮細(xì)胞和角質(zhì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。但它在理論上有耳毒性風(fēng)險(xiǎn)，目前尚缺乏其安全性和有效性的短期或長(zhǎng)期研究[22];（5）透明質(zhì)酸：是一種存在于黏多糖中的自然物質(zhì)，已被證實(shí)可促進(jìn)鼓膜穿孔愈合，并能減少新生鼓膜的瘢痕形成[23]。因此常被用做鼓膜修復(fù)的支架材料，尤其是經(jīng)化學(xué)修飾（如交聯(lián)或酯化）的新型透明質(zhì)酸材料。

2.3 合成材料

在合成材料中，已有聚甘油癸二酸酯（poly glycerol sebacate，PGS）、左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）被研究。PGS是一種可生物降解的合成多聚物，由聚甘油和癸二酸組成。PGS在栗鼠慢性鼓膜穿孔模型中顯示其能促進(jìn)細(xì)胞再生和新生血管形成[24]。該材料的優(yōu)點(diǎn)包括可調(diào)控的生物降解性、易于合成、良好的生物相容性等。此外，最新研究表明，PLLA和PLGA具有良好的生物相容性和安全性，并且在大鼠鼓膜穿孔動(dòng)物模型中可促進(jìn)鼓膜愈合，愈合的鼓膜具有正常的三層顯微結(jié)構(gòu)[25，26]。

3 生物活性分子

鼓膜穿孔愈合是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，是由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生物活性分子（如生長(zhǎng)因子）之間相互作用和介導(dǎo)的過(guò)程。在慢性鼓膜穿孔的研究中，不同的生物活性分子均扮演著促進(jìn)或延遲鼓膜愈合的角色。自從生長(zhǎng)因子和其受體在鼓膜穿孔愈合中的作用被證實(shí)后，各類(lèi)生長(zhǎng)因子開(kāi)始應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療中。

生長(zhǎng)因子可廣義上分為5種主要的家族：表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）。在鼓膜創(chuàng)傷愈合研究領(lǐng)域，EGF和FGF已被大量報(bào)道，而PDGF和TGF-β的研究比較有限，對(duì)于IGF目前僅有個(gè)別研究報(bào)道。

3.1 EGF家族

表皮生長(zhǎng)因子家族由表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）、肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）、雙向調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞素和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白組成。EGF主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖，尤其是在鼓膜鱗狀上皮細(xì)胞層[27]，它可在早期導(dǎo)致大量成纖維細(xì)胞和新生血管形成，伴隨致密的結(jié)締組織層形成[28]。重要的是，EGF在中耳內(nèi)無(wú)耳蝸與前庭毒性[29]，因此在人體中是安全的。TGF-α與EGF在結(jié)構(gòu)和功能上相似，但TGF-α已被證明在提高菌落分散中較EGF更有效[30]，而且是許多物質(zhì)的最有效的促進(jìn)因子。近期研究表明，在小鼠慢性鼓膜穿孔模型中，使用HB-EGF修復(fù)穿孔顯示出較好的鼓膜愈合狀態(tài)，并且聽(tīng)力恢復(fù)接近正常[31]。

3.2 FGF家族

在鼓膜中被研究較多的是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），bFGF主要引起鼓膜上皮層和纖維層的增生，但對(duì)黏膜層影響較小[32]。使用bFGF后的前3 d能刺激成纖維細(xì)胞增殖以供上皮的移行[33，34]，在3 d后通過(guò)舒張血管加速穿孔愈合[35]。臨床研究顯示，在鼓膜穿孔第3天后（即創(chuàng)傷愈合的增殖期）使用bFGF對(duì)鼓膜修復(fù)有顯著作用。該方法不僅可顯著縮短鼓膜穿孔愈合時(shí)間，還可減少臨床給藥持續(xù)時(shí)間和與bFGF相關(guān)的副作用的發(fā)生[36]。最近的臨床試驗(yàn)表明，每天持續(xù)小劑量bFGF[2～3滴/（次·d）]滴耳液能維持鼓膜潮濕環(huán)境，可促進(jìn)鼓膜穿孔愈合，避免繼發(fā)膿性耳漏，縮短愈合時(shí)間;相反，大劑量bFGF引起的鼓膜水樣環(huán)境反而可能繼發(fā)膿性耳漏，從而延長(zhǎng)愈合時(shí)間[37]。近期臨床試驗(yàn)表明，聯(lián)用bFGF、明膠海綿和fibrin膠水治療一組慢性鼓膜穿孔患者，其具有較高的成功率，且操作簡(jiǎn)單，不需要全身麻醉[38];然而，其中的作用機(jī)制和遠(yuǎn)期效果目前尚不清楚。在人類(lèi)中，與炎癥反應(yīng)過(guò)程對(duì)比，bFGF似乎更主要作用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程[39]。

3.3 PDGF家族

PDGF和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）組成一個(gè)高度受保護(hù)的PDGF/VEGF族。迄今為止，人們對(duì)鼓膜中的PDGF研究有限。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，用含PDGF的紙質(zhì)支架材料行局部治療6周，與對(duì)照組比較并沒(méi)有顯示出任何優(yōu)點(diǎn)[40]。VEGF能夠增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)新生血管的形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，是目前促進(jìn)血管生成專(zhuān)屬性最高、活性最強(qiáng)的因子[41]。對(duì)鼓膜中VEGF的研究表明VEGF是一種重要的促進(jìn)鼓膜血管再生的調(diào)節(jié)劑[42]。

3.4 TGF-β家族

TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，骨形態(tài)形成蛋白因子和激動(dòng)素。TGF-β由創(chuàng)傷后活化的血小板釋放，其對(duì)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成具有重要調(diào)節(jié)作用，在創(chuàng)傷愈合中具有多種生物學(xué)活性[43]。然而，TGF-β引起細(xì)胞外基質(zhì)在組織創(chuàng)面處沉積，從而導(dǎo)致過(guò)度的瘢痕增生以及纖維化[44]。

4 細(xì)胞來(lái)源

用于組織工程鼓膜的細(xì)胞可從機(jī)體組織、細(xì)胞系或干細(xì)胞中獲得。這些細(xì)胞在植入之前可以在體外被注入或者被混合成一定結(jié)構(gòu)[45]。當(dāng)前，細(xì)胞和生物支架聯(lián)合應(yīng)用于鼓膜穿孔治療的相關(guān)研究還比較有限。

自體同源成纖維細(xì)胞種植于豬脫細(xì)胞ADM或豚鼠脫細(xì)胞硬腦膜后，組織再生加速并且新的細(xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞種植組織中產(chǎn)生[46]。干細(xì)胞的作用也被擴(kuò)展到鼓膜穿孔愈合中，經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療的鼓膜在第1周后炎癥反應(yīng)減弱，治療2周后恢復(fù)鼓膜三層結(jié)構(gòu)[47]。然而，當(dāng)用于大鼠動(dòng)物模型時(shí)，卻沒(méi)有促進(jìn)鼓膜愈合。最新研究揭示人類(lèi)鼓膜祖細(xì)胞位于鼓膜臍部、鼓環(huán)和錘骨柄處，表明這些部位可能是鼓膜創(chuàng)傷愈合過(guò)程中干細(xì)胞再生活躍的部位[48]。

5 小結(jié)和展望

盡管既往在證明鼓膜創(chuàng)傷愈合的影響因素上做了許多努力，但是，慢性鼓膜穿孔的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，選擇何種生物活性分子和支架材料會(huì)產(chǎn)生最佳的鼓膜修復(fù)效果也亟待闡明。此外，缺乏一種可信的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型也是鼓膜創(chuàng)傷愈合研究領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)。無(wú)論細(xì)胞使用與否，支架材料和生物活性分子均是組織工程技術(shù)治療鼓膜穿孔的重要因素，兩者通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)促使鼓膜創(chuàng)傷愈合，支架材料提供了基質(zhì)支撐以引導(dǎo)鼓膜再生組織，而生物活性分子則促進(jìn)鼓膜細(xì)胞增殖和遷移。雖然鼓膜組織工程學(xué)已取得了較大進(jìn)步，但目前仍存在諸多挑戰(zhàn)，我們期望該領(lǐng)域研究不斷取得新的進(jìn)步，并且鼓膜組織工程新技術(shù)能夠在臨床中得到應(yīng)用。

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