王 勤，丁雨寅，陶俊燁，宋征宇，吳正紅，丁選勝*

(1.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京 211198；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198)

淫羊藿苷(icariin，ICA)是小檗科淫羊藿屬植物的主要有效成分[1]，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、影響生殖功能、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抗腫瘤及抗病毒等作用[2-3]。ICA難溶于水[4]，在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究表明口服生物利用度較低[5-6]，極大地限制了ICA的開發(fā)應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠胃腸道內(nèi)容物勻漿液體外實(shí)驗(yàn)法，研究其在胃和小腸各腸段的穩(wěn)定性，并推導(dǎo)其降解動(dòng)力學(xué)方程，以期為ICA的制劑開發(fā)利用和藥理作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 SPD20-A高效液相色譜儀(日本島津公司，包括LC-20AT溶劑輸送泵、UV-VIS檢測器、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥和LC Solution工作站)；RPL-D2000柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)；PHS-3C雷磁pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；MicroCL 21R超速冷凍離心機(jī)，Multiskan FC酶標(biāo)儀，902型超低溫冰箱(Thermo公司)；BT125D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH-S型恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2試藥 淫羊藿苷(批號(hào)JT171010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，陜西錦泰生物工程有限公司)；淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)110737-201516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.2%，中國食品藥品檢定研究院)；鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.0%～38.0%，分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)；氫氧化鈉(分析純，西隴化工股份有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，均為上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；磷酸二氫鈉(分析純，南京化學(xué)試劑一廠)；磷酸氫二鈉(分析純，江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8只SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，雌雄各半，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖廠提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2014-0001。分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫控制在24±2 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1ICA對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取ICA對(duì)照品20 mg，置于燒杯中，先用少量甲醇溶解，再移入100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的ICA對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2ICA供試品儲(chǔ)備液 精密稱取ICA樣品20 mg，置于燒杯中，先用少量甲醇溶解，再移入10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的供試品儲(chǔ)備液。

2.1.3大鼠胃腸道內(nèi)容物勻漿液的制備 取SD大鼠8只，雌雄各半，禁食不禁水24 h，斷頸椎處死后立即打開腹腔，冰上操作，其中4只用適量預(yù)冷的pH值為1.5的鹽酸溶液及pH值為4.5，6.5，6.8和8.0的磷酸鹽緩沖液沖洗胃、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，收集其內(nèi)容物，其余4只用預(yù)冷的生理鹽水收集全胃腸道內(nèi)容物。內(nèi)容物在4 ℃以5 000 r·min-1冷凍離心20 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，分別用相應(yīng)的緩沖液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至同一水平。

2.2色譜條件 色譜柱：Hedera ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水=3.4∶6.6；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

2.3方法學(xué)建立及考察

2.3.1專屬性考察 對(duì)大鼠胃和各腸段內(nèi)容物勻漿液中待測成分的色譜專屬性進(jìn)行分析，記錄圖譜，結(jié)果見圖1。由圖1可知，ICA峰形良好，各溶劑不產(chǎn)生干擾，專屬性良好。

圖1 不同內(nèi)容物中ICA的HPLC圖

a.流動(dòng)相；b.對(duì)照品；c.胃內(nèi)容物；d.十二指腸內(nèi)容物；e.空腸內(nèi)容物；f.回腸內(nèi)容物；g.結(jié)腸內(nèi)容物；1.ICA。

Fig.1 Chromatograms of ICA in different contents

a.mobile phase;b.control substance;c.gastric content;d.duodenal content;e.jejunal content;f.ileac content;g.colonic content; 1.ICA.

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取2.1.1項(xiàng)下制備的ICA對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25 mL，置于20 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，得質(zhì)量濃度為2.5 μg·mL-1的ICA對(duì)照品溶液；精密吸取5 mL上述ICA對(duì)照品溶液，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，得質(zhì)量濃度為1.25 μg·mL-1的ICA對(duì)照品溶液；分別精密量取2.1.1項(xiàng)下制備的ICA對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25，0.50，1.00 和2.00 mL，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為5，10，20 和40 μg·mL-1的ICA對(duì)照品溶液，用有機(jī)系濾頭過濾后，取中間段濾液，分別進(jìn)樣20 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，記錄峰面積。以ICA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=55 080x+19 380，r=0.999 7，結(jié)果表明，ICA質(zhì)量濃度在1.25～40 μg·mL-1范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.3.3精密度考察 精密吸取同一質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD值為0.58%，表明精密度符合定量測定的要求。

2.3.4回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的ICA對(duì)照品儲(chǔ)備液4，5和6 mL，置于3個(gè)10 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為80，100 和120 μg·mL-1的溶液，分別按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，各質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，按照外標(biāo)法計(jì)算得ICA平均回收率為97.53%(n=9，RSD平均值為0.19%)，表明該方法回收率良好。

2.3.5最低檢測限 吸取2.3.2項(xiàng)下配制的最低質(zhì)量濃度的ICA對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相逐步稀釋，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以ICA峰高接近基線噪音3倍時(shí)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為最低檢測限。結(jié)果測得最低檢測限為1.25 μg·mL-1。

2.3.6穩(wěn)定性與降解動(dòng)力學(xué)考察 精密稱取ICA原料藥20 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取0.25 mL，8份，分別置于8個(gè)25 mL量瓶中，分別加入以下8組介質(zhì)定容：①大鼠胃內(nèi)容物；②十二指腸內(nèi)容物；③空腸內(nèi)容物；④回腸內(nèi)容物；⑤結(jié)腸內(nèi)容物；⑥10 μg·mL-1全胃腸道內(nèi)容物；⑦20 μg·mL-1全胃腸道內(nèi)容物；⑧40 μg·mL-1全胃腸道內(nèi)容物，搖勻，用2 mL離心管分裝，封口膜密封，于37 ℃恒溫振搖0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，8.00，12.00和24.00 h， 以10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，立即冷卻終止反應(yīng)，0.45 μm水系濾膜過濾，取中間續(xù)濾液，進(jìn)樣20 μL，超出線性范圍的樣品用甲醇適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算ICA平均剩余百分率，見表1和表2。以平均剩余百分率為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制平均剩余百分率隨時(shí)間變化的曲線，見圖2和圖3?？疾霫CA在8種介質(zhì)中的穩(wěn)定性；按反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法計(jì)算反應(yīng)級(jí)數(shù)、表觀降解速率常數(shù)(KA)、半衰期(t0.5)和有效期(t0.9)，考察ICA在8種介質(zhì)中的降解動(dòng)力學(xué)特征，見表3和表4。

表1 ICA在不同胃腸道內(nèi)容物中的剩余率

Tab.1 Residual rates of ICA in different gastrointestinal contents

t/h不同胃腸道內(nèi)容物中剩余率/%胃十二指腸空腸回腸結(jié)腸0.00100.00100.00100.00100.00100.000.2571.6393.0156.7054.0599.370.5066.1679.0839.4740.6898.251.0063.9267.7935.0324.8897.602.0061.3053.9126.2410.6396.793.0058.4244.2323.884.4995.424.0056.2139.6119.932.5895.245.0054.4834.1115.61- 94.438.0049.8025.1411.45- 90.5112.0048.8619.027.91- 90.3424.0047.098.481.96- 82.04

注：-表示未檢測到。

表2 ICA在不同質(zhì)量濃度全胃腸道內(nèi)容物中的剩余率

Tab.2 Residual rates of ICA in different concentrations of total gastrointestinal contents

t/h不同質(zhì)量濃度(μg·mL-1)內(nèi)容物中剩余率/%1020400.0100.00100.00100.000.580.8671.7866.001.065.2348.4740.412.047.0926.0918.473.037.2614.516.944.027.336.872.595.022.353.67- 6.017.481.73- 8.011.27- -

注：-表示未檢測到。

圖2 ICA在不同胃腸道內(nèi)容物中時(shí)間-剩余含量曲線

注：C0表示ICA在不同胃腸道內(nèi)容物中的初始質(zhì)量濃度，Ct表示ICA在不同胃腸道內(nèi)容物中不同時(shí)間的質(zhì)量濃度。

Fig.2 Time-residual rate curves of ICA in different gastrointestinal contents

Note:C0is the initial mass concentration of ICA in different intestinal contents,Ctis the mass concentration of ICA in intestinal contents at different times.

圖3 ICA在不同質(zhì)量濃度全胃腸道內(nèi)容物中時(shí)間-剩余含量曲線

Fig.3 Time-residual rate curves of ICA in different concentrations of total gastrointestinal contents

表3 ICA在不同內(nèi)容物中的降解動(dòng)力學(xué)方程

Tab.3 Degradation kinetic equation of ICA in different contents

注：1～8分別代表胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、低質(zhì)量濃度全胃腸道、中質(zhì)量濃度全胃腸道、高質(zhì)量濃度全胃腸道內(nèi)容物。

表4 ICA在不同內(nèi)容物中的降解參數(shù)

Tab.4 Degradation parameters of ICA in different contents

降解介質(zhì)KAt0.9/ht0.5/h相關(guān)系數(shù)降解反應(yīng)級(jí)數(shù)胃0.037 52.8118.480.981 9一級(jí)十二指腸0.018 30.312.810.996 3二級(jí)空腸0.021 00.141.260.991 2二級(jí)回腸0.835 30.130.830.992 9一級(jí)結(jié)腸0.007 913.3487.720.986 5一級(jí)低質(zhì)量濃度全胃腸道0.051 60.111.010.992 4二級(jí)中質(zhì)量濃度全胃腸道0.667 40.161.040.999 0一級(jí)高質(zhì)量濃度全胃腸道0.909 10.120.760.997 3一級(jí)

3 討論

藥物在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性是藥物開發(fā)過程中必要的研究環(huán)節(jié)，特別是口服藥物在胃腸道的穩(wěn)定性將會(huì)直接影響藥物在胃腸道的吸收。文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠腸道分離出的腸道菌群將ICA迅速代謝成淫羊藿次苷Ⅱ[7]，且ICA在不同腸段的表觀滲透系數(shù)有顯著差異[8]。

由于食物在胃、小腸(十二指腸、空腸和回腸)、大腸(盲腸、結(jié)腸)的停留時(shí)間分別為4～6，6～8和18～24 h[9]，故本研究取樣時(shí)間點(diǎn)選擇0～24 h，最大程度地模擬ICA在胃腸道的停留情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，ICA在胃液(37 ℃，pH值1.5)中較穩(wěn)定，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。研究表明，ICA進(jìn)入腸道后被迅速水解[10]，在大鼠各腸段代謝成淫羊藿次苷后被吸收[8，10]。根據(jù)文獻(xiàn)[11]可知，以質(zhì)量濃度C對(duì)時(shí)間t作圖，若C-t作圖為直線則為零級(jí)反應(yīng)，ln(C/C0)-t作圖為直線則為一級(jí)反應(yīng)，1/C-t作圖為直線則為二級(jí)反應(yīng)，1/C2-t作圖為直線則為三級(jí)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICA在不同腸段內(nèi)容物中的穩(wěn)定性有顯著差異，其中結(jié)腸對(duì)ICA的代謝作用較弱，24 h內(nèi)僅降解18%；但易被小腸中的內(nèi)容物降解，其中十二指腸和空腸為二級(jí)降解反應(yīng)，半衰期分別為2.81和1.26 h，說明降解速度與內(nèi)容物質(zhì)量濃度相關(guān)；回腸為一級(jí)降解反應(yīng)，其降解速度最快，半衰期為0.83 h，4 h內(nèi)降解率高達(dá)97.5%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠腸黏膜上的乳糖酶根皮苷水解酶(LPH酶)[12-13]和腸道菌群對(duì)ICA具有分解作用[11,14]。不同腸段內(nèi)容物對(duì)ICA的降解速率不同可能是由于不同腸段酶的種類與質(zhì)量濃度以及腸道酸堿性不同導(dǎo)致的[15]。而ICA主要在小腸被降解吸收(大腸和胃由于吸收面積有限，不是藥物吸收的主要部位)，繼而在體內(nèi)發(fā)揮藥效。因此，可考慮設(shè)計(jì)十二指腸定位釋藥系統(tǒng)，提高ICA在小腸的分布以及提高活性降解產(chǎn)物的吸收效率。ICA在不同質(zhì)量濃度的全胃腸道內(nèi)容物中降解速率有顯著差異，低濃度為二級(jí)降解反應(yīng)，中濃度和高濃度為一級(jí)降解反應(yīng)。

ICA口服生物利用度低的原因可能是其在小腸極易被降解[11]，其在Caco-2細(xì)胞中表觀滲透系數(shù)較小[16]，或存在P糖蛋白和鈉離子依賴型外排系統(tǒng)[17-19]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為ICA口服劑型的設(shè)計(jì)提供參考。文獻(xiàn)報(bào)道ICA在體內(nèi)主要降解產(chǎn)物為淫羊藿次苷[20-21]，ICA降解產(chǎn)物在腸道的吸收及其在體內(nèi)的代謝機(jī)制還需進(jìn)一步研究。