周 希 鄭應(yīng)麟 俞燕露 戴 萌 袁 首 楊治芳

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南昌330006)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)一種自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血清甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)和/或甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平升高。近年有文獻(xiàn)報(bào)道提示SOCS1/3改變、T細(xì)胞亞群異常、病毒感染均可能與HT發(fā)病有關(guān)。細(xì)胞因子受體和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號(hào)通路對(duì)介導(dǎo)各種類(lèi)型細(xì)胞的存活、成熟和分化以及免疫功能的調(diào)節(jié)起重要作用，推測(cè)SOCS1通過(guò)直接和間接機(jī)制下調(diào)TLR信號(hào)[1]，SOCS1/3可能通過(guò)抑制JAK-STAT3信號(hào)通路調(diào)控輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)的分化[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血SOCS1/3、TLR3表達(dá)及T細(xì)胞亞群分化水平，進(jìn)一步明確SOCS1/3對(duì)TLR3表達(dá)及T細(xì)胞亞群分化的調(diào)控及其在HT發(fā)病中的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料 收集2014年10月～2016年5月期間在我院內(nèi)分泌科門(mén)診及住院部已確診的HT患者40例(男7例，女33例，年齡25～45歲，平均年齡32.5歲)及正常體檢人群30例(男11例，女19例，平均年齡36.5歲)。具體納入標(biāo)準(zhǔn)：HT組參照《2008年甲狀腺疾病診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)照組為與HT組年齡相匹配的健康人。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類(lèi)型的甲狀腺疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、感染狀態(tài)及妊娠者。

1.2方法

1.2.1收集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,Treg)、濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular helper T cell,Tfh)細(xì)胞及Th17細(xì)胞 收集HT組患者與對(duì)照組標(biāo)本的外周血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)：①取1×106細(xì)胞加入1 ml 1640完全培養(yǎng)液，加入佛波酯50 ng/ml，離子霉素2 μg/ml，莫能霉素1 μg/ml；5 h后收集細(xì)胞，4℃、500 g離心5 min，PBS洗滌2次，100 μl PBS重懸，設(shè)立同型對(duì)照組，加入CD4抗體0.5 μl，于4℃冰箱染色30 min。染色結(jié)束，PBS洗滌2次，加入500 μl破膜液(IC fixatin buffer)，4℃避光10 min，4℃、500 g離心5 min。加入1×破膜緩沖液500 μl洗滌細(xì)胞2次，4℃、500 g離心5 min。加入1×破膜緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，加入5 μl 的PE標(biāo)記的抗人IL-17A抗體染色，4℃避光60 min，加入1×破膜緩沖液1 ml重復(fù)洗滌2次，4℃、500 g離心5 min，最后重懸于200 μl PBS中。②吸取新鮮全血標(biāo)本100 μl置于流式管中，加入CD4、CD25、CD127抗體，室溫避光15 min。加入溶血素 1 ml，室溫避光10 min，1 000 r/min離心5 min，后加入1.5 ml 的PBS離心1 000 r/min 5 min，加入250 μl PBS。③取100 μl新鮮抗凝血于流式管，加入CD4-FITC、CXCR5(CD185)-PE標(biāo)記的單克隆抗體10 μl，微振蕩使抗體與全血充分混勻，室溫條件下避光15 min，加入溶血素1 ml，室溫條件下避光10 min；1 000 r/min離心5 min，加入1.5 ml PBS振蕩混勻，以去除多余的抗體；1 000 r/min離心5 min，加入250 μl PBS，均放入流式儀中。

1.2.2檢測(cè)血漿SOCS1/3、STAT3蛋白表達(dá)水平 采用ELISA檢測(cè)HT組(30例)和對(duì)照組(30例)血漿中SOCS1/3、STAT3蛋白表達(dá)的變化。

1.2.3檢測(cè)甲狀腺組織中TLR3、SOCS1/3蛋白的表達(dá)和定位 收集HT組(30例)和對(duì)照組(10例)甲狀腺組織標(biāo)本，IHC檢測(cè)SOCS1/3及TLR3蛋白在甲狀腺組織的表達(dá)與定位，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分。

1.2.4檢測(cè)PBMCs中TLR3、SOCS1/3、STAT3、RORγt、Bcl6、Foxp3 mRNA表達(dá)水平 Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs，Trizol抽提PBMCs的總RNA，PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃，10 min；循環(huán)(40次)95℃，15 s→60℃，60 s；溶解曲線75℃→95℃，每20 s升溫1℃。

2 結(jié)果

2.1HT組及對(duì)照組PBMCs中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞及Tfh細(xì)胞的數(shù)量比較 流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)HT組Treg細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組，Th17細(xì)胞、Tfh細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2。

2.2HT組及對(duì)照組PBMCs中SOCS1/3、STAT3、TLR3、RORγt、Foxp3、Bcl6 mRNA的表達(dá) HT組與對(duì)照組相比，STAT3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；SOCS1/3、TLR3、RORγt、Bcl6 mRNA的表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞及Tfh細(xì)胞數(shù)量百分比(%)Fig.1 Detection of Treg cells，Tfh cells and Th17 cells percentage by flow cytometry(%)Note: A-C in control group；D-F in HT group;A and D represent Treg cells percentage;B and E represent Th17 cells percentage;C and F represent Tfh cells percentage.

GroupsTLR3SOCS1SOCS3Bcl6RORγtSTAT3 Foxp3HT group 1.621 0±1.541 91) 2.377 0±1.762 61) 1.671 3±1.013 31)3.411 3±2.660 81)1.11±0.951)0.59±0.471)3.40±0.881)Control group 0.887 7±0.533 11.309 7±0.839 90.863 0±0.510 81.245 3±0.774 20.36±0.221.94±1.095.11±1.30

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖2 HT組及對(duì)照組Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Tfh細(xì)胞數(shù)量比例(%)Fig.2 Ratio of Treg cells,Th17 cells and Tfh cells in HT group and control group(%)Note: Compared with control group，*.P<0.05.

圖3 TLR3、SOCS1/3在甲狀腺組織中的免疫組化染色結(jié)果(×100)Fig.3 IHC detection of TLR3 and SOCS1/3 in thyroid tissue (×100)Note: A.The expression of TLR3 in the HT group;B.The expression of TLR3 in the control group;C.The expression of SOCS1 in the HT group;D.The expression of SOCS1 in the control group;E.The expression of SOCS3 in the HT group;F.The expression of SOCS3 in the control group.

2.3HT組及對(duì)照組組織中TLR3、SCLS1/3的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示TLR3、SOCS1/3蛋白均陽(yáng)性表達(dá)于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)，見(jiàn)圖3。Fisher精確概率法分析TLR3蛋白在兩組甲狀腺組織中表達(dá)的差異，TLR3在HT組的表達(dá)評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。非參數(shù)檢驗(yàn)方法比較SOCS1/3蛋白在各組甲狀腺組織中的表達(dá)，按照著色范圍以及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。著色范圍以陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，按0、<10%、10%～50%、50%～80%、>80%分別計(jì)0、1、2、3、4分，染色強(qiáng)度按無(wú)著色、淺著色、中等強(qiáng)度著色、深著色，分別計(jì)0、1、2、3分。上述兩項(xiàng)乘積為最終分?jǐn)?shù)(0～12分)，SOCS1和SOCS3蛋白在HT組的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 TLR3蛋白在甲狀腺組織中的表達(dá)情況

Tab.2 Protein expression of TLR3 in thyroid tissue

GroupsPositive(n)Negative(n)Positive rateHT group300100%Control group2820%

表3 SOCS1/3蛋白在甲狀腺組織中的表達(dá)評(píng)分

Tab.3 Expression score of SOCS1/3 protein in thyroid tissue

GroupsSOCS1-++++++SOCS3-++++++HT group9155191290Control group730010000

GroupsnSOCS1SOCS3STAT3Control group30242.57±19.29269.15±24.7894.04±7.83HT group 30291.17±21.81)326.29±20.021)54.87±6.891)

Note：Compared with control group，1)P<0.05.

2.4HT組與對(duì)照組外周血中SOCS1/3、STAT3 蛋白表達(dá)情況 HT組SOCS1/3蛋白濃度比對(duì)照組上調(diào)，STAT3蛋白濃度下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

3 討論

HT的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，大多研究提示與免疫機(jī)制有關(guān)，但具體相關(guān)免疫機(jī)制尚未明確。

3.1SOCS1/3對(duì)T細(xì)胞分化調(diào)控在HT發(fā)病中的可能相關(guān)機(jī)制 SOCS1/3是細(xì)胞因子的重要負(fù)調(diào)節(jié)物，SOCS1/3通過(guò)觸發(fā)JAK-STAT途徑上的反饋環(huán)而被充分表征，并且是促炎細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的最有效的負(fù)調(diào)節(jié)物[3-5]，而STAT3是維持Th17和Treg細(xì)胞平衡以及CD4+T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵[6]。Treg細(xì)胞是促進(jìn)機(jī)體對(duì)自體組分的免疫耐受并維持免疫穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞，降低Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能導(dǎo)致自身免疫耐受缺陷和對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答異常，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病[7-9]。Foxp3是維持Treg細(xì)胞發(fā)育和功能分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。現(xiàn)已明確，Treg和Th17細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中表現(xiàn)相反作用。HT患者外周血中Th17細(xì)胞比例明顯增加，并且其特征性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)也顯著增高[10]。孫慶凱等[11]研究顯示HT患者SOCS1/3表達(dá)增加，且與Th17/Treg比值呈負(fù)相關(guān)。Tfh細(xì)胞是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，為B細(xì)胞提供幫助并促進(jìn)生發(fā)中心(GCs)的形成。Tfh細(xì)胞向B細(xì)胞傳輸重要信號(hào)，這些信號(hào)驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞類(lèi)別重組，體細(xì)胞超突變，產(chǎn)生高親和力抗體；免疫記憶及其在GC中分化成漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞[12]。研究顯示Bcl6指導(dǎo)Tfh細(xì)胞分化，Bcl6缺陷T細(xì)胞未能發(fā)育成Tfh細(xì)胞，不能維持生發(fā)中心反應(yīng)[13]。Choi等[14]認(rèn)為SOCS3可能通過(guò)抑制IL-6/STAT1-STAT3/Bcl6信號(hào)軸影響Tfh細(xì)胞分化。本研究檢測(cè)到SOCS1/3主要表達(dá)在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的胞漿中，與對(duì)照組相比，HT組表達(dá)明顯增多。HT組PBMCs中SOCS1/3 mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組，STAT3 mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組。HT組中Treg細(xì)胞的百分比及Foxp3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，Tfh、Th17細(xì)胞比例及RORγt、Bcl6 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。因此我們推測(cè)HT中SOCS1/3升高反饋抑制STAT3的活化，參與影響Treg、Th17及Tfh細(xì)胞的分化。

3.2SOCS1/3對(duì)TLR3表達(dá)調(diào)控在HT發(fā)病中的可能相關(guān)機(jī)制 TLR是細(xì)胞外跨膜糖蛋白，是進(jìn)化轉(zhuǎn)增受體，在先天性免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[15]。多種細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物組分能夠刺激TLR介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。Yoshimura等[16]發(fā)現(xiàn)SOCS1通過(guò)各種感染途經(jīng)誘導(dǎo)并抑制TLR信號(hào)、IL-12產(chǎn)生和IFNγ應(yīng)答，且認(rèn)為這是微生物逃避宿主免疫的重要機(jī)制。已有研究顯示TLR3在HT和Graves病患者的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞高度表達(dá)[17]。本研究結(jié)果顯示HT患者的甲狀腺組織中均可以檢測(cè)到TLR3的表達(dá)，其主要定位在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，而在對(duì)照組中幾乎不表達(dá)，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)HT組TLR3 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。本研究閱片時(shí)發(fā)現(xiàn)SOCS1/3與TLR3在甲狀腺上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)的表達(dá)區(qū)域大致相同，提示TLR3可能在HT病毒感染早期表達(dá)增加，機(jī)體為避免過(guò)強(qiáng)免疫反應(yīng)，進(jìn)而激活SOCS1/3的表達(dá)。

因此我們推測(cè)SOCS1/3通過(guò)影響TLR3表達(dá)及T細(xì)胞亞群分化參與HT發(fā)病，但本研究只是初步探討HT可能發(fā)病機(jī)制，具體相關(guān)發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。早期對(duì)其傳導(dǎo)路徑進(jìn)行干預(yù)或阻斷可盡量延緩或阻斷HT的進(jìn)展，為將來(lái)尋求HT治療提供新的思路。