潘克女 張永樂 張 鈞 左中寶 俞 哲 劉壽榮

(浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗科，杭州310016)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染的發(fā)病機制十分復雜，其發(fā)展和預后主要取決于宿主的免疫狀態(tài)。在乙肝病毒感染的過程中，病毒本身并不會直接引起肝細胞損傷，而是宿主免疫系統(tǒng)的抗病毒免疫應(yīng)答導致肝細胞損傷和各種肝臟疾病的發(fā)生。在宿主免疫應(yīng)答過程中，T淋巴細胞亞群失衡可能是導致乙型肝炎慢性化過程中的主要原因，胸腺是機體的中樞免疫器官，是T細胞發(fā)育、分化、成熟的場所，因此在乙型肝炎慢性化發(fā)生、發(fā)展及預后的過程中胸腺功能都具有極其重要的意義[1]。本文采用TaqMan-MGB雙標記探針技術(shù)建立實時熒光定量PCR方法檢測外周血中TRECs的含量。并將此技術(shù)應(yīng)用于檢測慢性乙型肝炎(CHB)患者PBMCs中TRECs的含量，進而了解CHB患者的胸腺近期輸出功能，并分析TRECs含量在健康人群與CHB患者中的差異，現(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 45例慢性乙型肝炎中型患者為2016年9月～2017年6月在杭州市西溪醫(yī)院就診的住院患者，其中男35例，女10例，年齡最小25歲，最大45歲，平均38.51歲。慢性乙型肝炎診斷標準符合2015更新版《慢性乙型肝炎防治指南》[2]，排除其他型肝炎及肝損傷的相關(guān)疾病。35例健康人群為2017年職工體檢人群，排除各種引起肝損傷的相關(guān)疾病。

1.1.2儀器與試劑 型號SLAN-96實時熒光定量PCR儀購自上海宏石公司，高速冷凍離心機以及連續(xù)可調(diào)移液器購自德國Eppendorf公司。實時熒光定量PCR試劑中Buffer、DNTP、Mg2+、Taq酶等基礎(chǔ)原料購自TaKaRa Biotec；引物，探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；外周淋巴細胞分離及核酸抽提試劑購自廣州藍吉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1標本處理 取EDTA抗凝血1 ml，用等體積的PBS進行稀釋后，輕輕轉(zhuǎn)入2 ml的淋巴分離液中(沿管壁輕輕轉(zhuǎn)入，使稀釋全血完全浮于淋巴分離液之上)，采用水平冷凍離心機2 500 r/min離心15 min，吸取中間云霧狀漂浮物置于5 ml離心管,加 2 ml的PBS，12 000 r/min離心10 min棄上清，重復洗滌4次。將沉淀調(diào)成溶液，取溶液10 μl滴入計數(shù)板，在顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)量，將溶液中的細胞數(shù)量稀釋為1×106個/ml。采用QiagenMini Blood min柱提試劑盒，具體操作：取200 μl調(diào)整好的細胞溶液中加入20 μl蛋白酶K和200 μl細胞裂解液(Cell lysis solution)，充分混勻后,56℃水浴10 min,取出加入無水乙醇200 μl充分混勻后全部轉(zhuǎn)入帶濾膜的柱中10 000 r/min離心2 min,棄廢液，向柱中加入預配好的DW1洗液600 μl,再次10 000 r/min離心2 min,棄廢液，向柱中加入預配好的DW2洗液600 μl，離心10 000 r/min，2 min;將柱轉(zhuǎn)入潔凈離心管中10 000 r/min離心5 min,棄離心管，更換另一潔凈離心管將柱置入，開蓋室溫放置5 min,使殘余酒精充分揮發(fā)后，向柱中加入50 μl GE洗脫液(注意洗脫液加入膜的中間，但禁止移液槍頭接觸膜)，關(guān)蓋室溫放置5 min，10 000 r/min離心2 min,收集總DNA備用。

1.2.2引物設(shè)計 根據(jù)TCRδ基因序列(ACCESS-ION AE000661)中δRec基因片段的下游設(shè)計一條上游引物P1 5′-CACATCCCTTTCAACCATGCT-3′,同時在ΨJɑ的上游設(shè)計一條下游引物P2 5′-GCCAGCTGCAGGGTTTAGG-3′ 在擴增片段中設(shè)計一條5′端標記FAM熒光在3′端標記MGB熒光的雙熒光探針5′-FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACTMGB-3′。該引物的設(shè)計與一般的PCR 引物相反,因為TRECsDNA在δRec 和ψJα的兩個基因片段刪除重組形成一環(huán)狀DNA,所以設(shè)計引物時特別考慮這一特點，只有形成了DNA 環(huán)，才能擴增出相應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測TRECs反應(yīng)體系的配比及擴增條件 Buffer 5 μl,4 mmol/L的MgCl21 μl,Taq酶1.5 U 1 μl,dNTP 0.2 mmol/L 4 μl,0.5 μmol/L的上游引物下有引物各1 μl，0.1 μmol/L的熒光探針1 μl,ddH2O 31 μl,模板5 μl合計50 μl。擴增程序為:37℃ 5 min,95℃3 min,95℃15 s,60℃ 45 s運行45個循環(huán)，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1TaqMan-MGB雙標記探針PCR定量方法性能評價

2.1.1反應(yīng)體系的特異性和準確性 經(jīng)過多次調(diào)試最終完成了實時熒光雙探針標記的PCR反應(yīng)體系，對含目的基因的反應(yīng)體系在擴增45個循環(huán)后會出現(xiàn)光滑完整的“S”型動力曲線，對不含目的基因的反應(yīng)體系表現(xiàn)為平直曲線；特異性：采用該反應(yīng)體系對已確認陽性的解脲支原體DNA，沙眼衣原體DNA，皰疹病毒2型DNA，淋球菌DNA(UUDNA，CTDNA，HSV2DNA，NGDNA)以及HBVDNA各5例進行檢測結(jié)果均顯示陰性(所有對比標本均采用中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的商品化試劑盒進行確認陽性的標本)。準確性：采用該體系經(jīng)行PCR檢測產(chǎn)物在2%的瓊脂糖電泳里125 bp處出現(xiàn)明顯擴增條帶，該條帶與預期產(chǎn)物量一致，7號帶為陰性對照無條帶見圖1，并對1～6號標本產(chǎn)物進行基因測序驗證結(jié)果與目的基因序列完全吻合。

2.1.2靈敏度 根據(jù)ISO15189試劑和性能驗證的方案我們對5×105copies的質(zhì)粒進行10倍法稀釋到50 copies，并進行20次檢測最終有19例被檢出，檢出率95%，因此可判定最低檢出限可達50 copies，結(jié)果見圖2。

圖1 TRECs real-time PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis diagram by TRECs real-time PCRNote:M.50 bp DNA Ladder；1.Plasmid standard；2-6.Samples；7.Negative.

圖2 TRECs反應(yīng)體系靈敏度實驗圖Fig.2 Experimental map of TRECs

2.1.3重復性 對6.18 Lg copies/106PBMCs和3.54 Lg copies/106PBMCs高低濃度標本同一批次進行25次檢測結(jié)果平均值為6.08±0.14，3.52±0.18 Lg copies/106PBMCs批內(nèi)變異系數(shù)CV分別為2.26%，5.12%，對這兩份標本連續(xù)5 d重復20次試驗結(jié)果平均值為6.10±0.23，3.51±0.22 Lg copies/106PBMCs批間變異系數(shù)CV分別為3.85%，6.27%。批內(nèi)，批間CV均小于10%表明該方法具有較高的重復性，數(shù)據(jù)見圖3、4，表1。

2.1.4標準曲線參數(shù) 對標準質(zhì)粒進行10倍稀釋后擴增所得擴增曲線見圖5，斜率-3.038 86，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.999 33，縱截距為39.056。

2.2健康對照者與慢性乙型肝炎中型患者TRECs含量的比較 35例健康對照和45例慢型乙肝炎中型患者的外周血TRECs經(jīng)PCR定量檢測結(jié)果 35例健康成人的外周血TRECs平均含量為4.82±1.28 Lg copies/106PBMCs，45例慢性乙型肝炎中型患者外周血TRECs平均含量為4.09±0.97 Lg copies/106PBMCs，兩者比較存在統(tǒng)計學差異t=11.25,P<0.05，結(jié)果見圖6。

圖3 低濃度標本25次重復實驗驗證Fig.3 Low concentration specimen 25 repeated experi-mental verification

圖4 高濃度標本25次重復實驗驗證Fig.4 High concentration specimen 25 repeated experi-mental verification

圖5 TRECs real-time PCR標準曲線定量圖Fig.5 Standard curve diagram of TRECs real-time PCR

表1 6.18與3.54 Lgcopies/106PBMCs高低濃度標本批內(nèi)差異分析

Tab.1 Difference between within-run of 6.18 and 3.54 Lg copies/106PBMCs

No.Within-runHighLow 16.253.72 26.033.6635.973.0246.253.5156.273.6165.983.5676.303.6686.183.6296.343.52105.943.62115.963.62126.053.66136.303.51145.963.29156.083.35166.043.37176.073.49185.943.65196.123.65206.073.51215.963.22225.873.71236.123.63246.033.18255.953.60AVG6.083.52SD0.140.18CV%2.265.12

Note：AVG.Average;SD.Standard deviation;CV.Coefficient of variation.

圖6 慢性乙型肝炎中型(CHB M)及健康對照(HCS)組間TRECs含量比較(Lg copies/106PBMC)Fig.6 Determination results of TRECs in patients with CHB and HCS(Lg copies/106PBMC)

表2 6.18與3.54 Lg copies/106PBMCs高低濃度標本批間差異分析

Tab.2 Difference between-run of 6.18 and 3.54 Lg copies/106PBMCs

TimeNo.Between-runHighLow 1st day16.033.3526.293.7936.013.7545.573.2155.683.342nd day66.313.5275.963.5086.513.7295.913.18105.993.863rd day115.973.84126.023.41136.283.39146.003.61156.383.404th day166.003.54176.343.10186.243.56196.213.41206.253.64AVG6.103.51SD0.230.22CV%3.856.27

Note：We made a statistical analysis of results from 20 repeated experiments,which were performed 5 times a day for 4 consecutive days.AVG.Average;SD.Standard deviation;CV.Coefficient of variation.

3 討論

胸腺是機體中樞免疫器官，約有90%成熟T細胞受體(T-cell receptor,TCR)細胞來源于胸腺，早期胸腺是T淋巴細胞分化、發(fā)育、成熟的主要場所，隨著年齡的增長胸腺的這一功能逐漸減弱，盡管胸腺輸出功能與年齡呈負相關(guān)，但近年的研究表明，成人胸腺仍持續(xù)產(chǎn)生初始的、新分化的T細胞輸送至外周[3]。研究發(fā)現(xiàn)人免疫缺陷病毒(Human immunod-eficiency virus,HIV)感染者較健康人群胸腺功能有所降低[4]。HIV感染后經(jīng)過高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)以及白血病經(jīng)造血干細胞移植后，胸腺功能較治療前都有明顯改善[5，6]。所以人們認為，胸腺功能的檢測是研究免疫功能、免疫缺陷及細胞免疫重建等相關(guān)疾病的重要手段。T細胞由多能干細胞發(fā)育分化而來，包括了TCR的發(fā)育及T細胞的陽性與陰性選擇以及發(fā)育為成熟T細胞。而TCR的成熟過程需要經(jīng)過一系列基因有序表達和關(guān)閉，基因重排是其中最重要的一步，在重排過程中δ鏈基因的刪除70%是通過位于δ鏈基因座兩側(cè)的δRec和ψJα兩個刪除片段的特異重組形成DNA而刪除，該DNA環(huán)即T細胞受體重排刪除環(huán)(TRECs)[7]，是TCR基因重排過程中產(chǎn)生的、性質(zhì)穩(wěn)定的環(huán)形游離DNA，出現(xiàn)在胸腺T細胞分化的晚期，在T細胞增殖過程中不能復制，而是逐漸被稀釋。功能性TCR重排完成后，αβTCR即表達在T細胞表面，TRECs只存在于具有初始表型的αβT細胞，而外周血95%以上的T細胞為αβT細胞，所以外周血單個核細胞TRECs含量基本上代表了TCR基因初始重排形成功能性TCR基因時的初始或幼稚T細胞的含量[8，9]。國外學者利用TRECs含量來評價腎移植后合并巨細胞病毒感染者的免疫狀況[10]。因此TRECs用于評價胸腺近期輸出功能已被廣泛接受，然而選擇合適的檢測方法顯得至關(guān)重要。

目前實時熒光定量PCR技術(shù)中，TaqMan探針法是最常用且最有應(yīng)用前景的方法，現(xiàn)已開發(fā)了多種商品化試劑盒應(yīng)用在病毒、細菌、病原微生物等方面。TaqMan-MGB雙標記探針定量技術(shù)屬于TaqMan探針的一種，MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團本身不產(chǎn)生熒光可以大大降低本底信號的強度，同時探針上還連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團可以將探針的Tm值提高10℃左右。因此在同樣的Tm值時MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。通常在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，對探針的設(shè)計要求極高，探針長度相應(yīng)縮短，此時MGB探針更容易勝任。在實驗過程中該技術(shù)產(chǎn)生熒光本底低，分辨率高，使實驗結(jié)果更精確，特異性增強，更適合模板數(shù)量低的檢測。譚翰清等[11]采用該技術(shù)對H5N6禽流感進行定量檢測，沈維祥等[12]利用TaqMan-MGB技術(shù)檢測幽門桿菌耐藥突變，兩位學者的實驗均取得較好的結(jié)果，他們也認為該技術(shù)特異性強，靈敏度高具有較好的推廣應(yīng)用前景。

本研究通過多次實驗成功建立了實時熒光TaqMan-MGB探針技術(shù)檢測TRECs含量。通過電泳我們發(fā)現(xiàn)在125 bp處出現(xiàn)明顯擴增條帶，該條帶與預期產(chǎn)物量一致，無雜帶出現(xiàn)且陰性對照無條帶。通過對質(zhì)粒進行10倍稀釋建立標準品，利用該體系檢測標準品其曲線斜率為3.038 86，符合PCR擴增理論中的濃度相差10倍擴增原始增長點相差3.333個循環(huán)；相關(guān)性為0.999 33，說明該體系有較高的穩(wěn)定性。對高低濃度標本進行同次25次復孔實驗和分批20次試驗后進行統(tǒng)計變異系數(shù)均小于10%，更能體現(xiàn)該體系的穩(wěn)定性。對質(zhì)粒進行10倍稀釋直到50 copies時復孔20次實驗19孔檢出，檢出率95%，說明該體系的靈敏度可達50 copies。對多種病原體DNA進行交叉試驗，均未檢出陽性曲線，說明該體系具有較高的特異性。近期國外學者也采用實時熒光定量PCR技術(shù)建立了TRECs檢測方法用來評價新生重癥免疫缺陷的免疫功能[13]，本研究的熒光探針采用TaqMan-MGB，從擴增曲線上看曲線更為光滑，結(jié)果更為可靠。

筆者對45例慢性乙肝肝炎感染的成人和35例同年齡段的健康人群采用TaqMan-MGB探針法進行定量分析外周血中TRECs含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康成人的外周血TRECs平均含量為4.82±1.28 Lg copies/106PBMCs，慢性乙型肝炎患者外周血TRECs平均含量為4.09±0.97 Lg copies/106PBMCs，兩者比較差異存在統(tǒng)計學意義，慢性乙型肝炎感染人TRECs含量低于健康人群，說明慢性乙型肝炎感染人群的胸腺近期輸出功能是降低的，這一結(jié)論與慢性乙型肝炎的免疫功能下降理論相一致[14]。與馬旭明等[15]報道急性冠脈綜合征患者與健康人間TRECs含的結(jié)論一致，他們研究表明急性冠脈綜合征患者胸腺近期輸出功能顯著低于健康人群，認為TRECs含量能夠用于評價機體近期免疫功能。

綜合實驗結(jié)果，筆者認為實時熒光TaqMan-MGB探針定量PCR測定外周血中TRECs含量方法的建立，為評判胸腺近期輸出功能提供新的診療手段，彌補了初期通過B超技術(shù)測量胸腺大小來判斷胸腺功能的不足。該方法簡單、快速、靈敏度高和特異性強的特點值得臨床推廣。尤其是如今對慢性乙型肝炎免疫調(diào)節(jié)治療的療效觀測或是對核苷酸類藥物抗病毒治療停藥后患者免疫狀態(tài)的改變監(jiān)測都具有重要意義。