李 冰 周 平 靳 義

(哈勵遜國際和平醫(yī)院胸外科,衡水053000)

肺癌是世界上最常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因。2012年全世界新增肺癌病例180萬，肺癌死亡病例160萬[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是一種異質(zhì)性腫瘤，大約占所有肺癌的85%[2]。目前對早期肺癌患者一般采用外科手術(shù)，而對患有手術(shù)切除的醫(yī)學(xué)禁忌證或者不愿意進(jìn)行手術(shù)的患者則采用高劑量立體定向輻射。而對于晚期肺癌患者則無法進(jìn)行手術(shù)切除，一般采用胸部放射治療的同時(shí)使用順鉑或卡鉑進(jìn)行雙重化療。由于階段和地區(qū)的不同，肺癌的生存率從4%到17%不等[3]。有數(shù)據(jù)顯示中藥輔助治療可提高肺癌患者的整體生存率[4]。越來越多的研究表明中草藥在癌癥治療中發(fā)揮著積極作用[5-7]。中草藥姜黃常用于治療消化不良，腸胃氣脹，發(fā)燒和咳嗽等疾病[8]。吉馬酮是姜黃的主要生物活性成分之一，具有抗病毒，抗氧化及抗炎等功效[9-11]。另外，吉馬酮還有利于乳腺癌，肝癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療[12-14]。但吉馬酮在肺癌中的作用還未見報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。本文的主要目的是探索吉馬酮對人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞增殖，凋亡，侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞系來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。培養(yǎng)基 DMEM、胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Solarbio。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司?？辜?xì)胞增殖核抗原-67(antigen identified by monoclonal antibody,Ki67)抗體、抗Cleaved Caspase-3抗體和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖到80%左右時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分為4組：對照組，吉馬酮(5、10、20 μmol/L)組。對照組用DMSO進(jìn)行處理。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞活力及增殖 不同濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的吉馬酮處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞48 h后，利用CCK-8按照試劑盒說明書檢測不同處理濃度下的細(xì)胞活力。低中高劑量(5、10、20 μmol/L)吉馬酮處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞0、1、2、3、4 d后，按照試劑盒說明書通過CCK-8檢測不同時(shí)間點(diǎn)NCI-H1770細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 吉馬酮處理48 h 后收集各組待測細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后用1×的Binding buffer將細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的懸液。然后加入Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，室溫，避光，輕輕地混勻，孵育10 min。再加入碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，室溫，避光，孵育5 min。最后利用流式細(xì)胞儀對染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.4Transwell檢測細(xì)胞侵襲 首先將各組待測細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml的懸液，然后將上述細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，同時(shí)在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后，用蘇木精對上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 首先用10 μg/ml的絲裂霉素C處理各組細(xì)胞1 h后，將各組待測細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入6孔板中，過夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。在單層細(xì)胞上用10 μl的槍頭劃橫線，PBS洗3次，除去因劃痕而脫落的細(xì)胞。顯微鏡下拍照測量劃痕寬度，培養(yǎng)24 h后再取出拍照測量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.6蛋白印跡檢測Ki67、Cleaved Caspase-3和VEGF表達(dá) 先用PBS將各組待測細(xì)胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間進(jìn)行單因素方差分析后再進(jìn)行Duncan′s multiple range test檢驗(yàn)。P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞活力的影響 通過CCK-8檢測細(xì)胞毒性，分析吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770、A549細(xì)胞活力的影響。圖1顯示，當(dāng)吉馬酮濃度<20 μmol/L時(shí)，NCI-H1770和A549細(xì)胞活力維持在80%以上。當(dāng)吉馬酮濃度≥20 μmol/L時(shí)，NCI-H1770細(xì)胞活力急劇下降，降到80%以下。上述結(jié)果說明，低濃度(<20 μmol/L)的吉馬酮不會對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，高濃度(≥20 μmol/L)的吉馬酮會急劇減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力。

2.2吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞增殖的影響 為分析吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞增殖的影響，利用CCK-8檢測不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖倍數(shù)。如圖2所示，吉馬酮(10、20 μmol/L)組細(xì)胞增殖倍數(shù)低于對照組(P<0.01)。

圖1 CCK-8檢測細(xì)胞活力Fig.1 Cell viability was detected by CCK-8

圖2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖Fig.2 Cell proliferation was measured by CCK-8Note: **.P<0.01 vs control group.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis was tested by flow cytometryNote: **.P<0.01 vs control group.

以上結(jié)果表明,吉馬酮可降低非小細(xì)胞肺癌增殖能力。

2.3吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞凋亡的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)分析吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞凋亡的影響。由圖3可知，吉馬酮(5、10、20 μmol/L)組細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.01)。由此可見，吉馬酮可提高非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞凋亡。

圖4 Transwell檢測細(xì)胞侵襲Fig.4 Cell invasion was detected by TranswellNote: **.P<0.01 vs control group.

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移Fig.5 Cell migration was measured by wound healingNote: **.P<0.01 vs control group.

圖6 蛋白印跡檢測增殖、凋亡及運(yùn)動相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of proliferation,apoptosis and motility related proteins was tested by Western blotNote: **.P<0.01 vs control group.

2.4吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞侵襲的影響 利用Transwell檢測細(xì)胞侵襲，分析吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞侵襲的影響。圖4顯示，吉馬酮(5、10、20 μmol/L)組每個(gè)視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)目低于對照組(P<0.01)。上述結(jié)果說明，吉馬酮可減弱非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞侵襲能力。

2.5吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞遷移的影響 為分析吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞遷移的影響，利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移。如圖5所示，吉馬酮(5、10、20 μmol/L)組劃痕愈合率低于對照組(P<0.01)。以上結(jié)果表明，吉馬酮可降低非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞遷移能力。

2.6吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及運(yùn)動相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 通過蛋白印跡檢測Ki67,Cleaved Caspase-3和VEGF表達(dá)，分析吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞增殖，凋亡及運(yùn)動相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。由圖6可知，與對照組相比，吉馬酮(5、10、20 μmol/L)組Ki67和VEGF的相對蛋白水平下降，Cleaved Caspase-3的相對蛋白水平上升(P<0.01)。由此可見，吉馬酮可減輕非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770細(xì)胞增殖，凋亡及運(yùn)動相關(guān)蛋白表達(dá)的異常。

3 討論

肺癌也是中國最為普遍的癌癥，2015年中國新增肺癌病例73.3萬。肺癌死亡病例61萬[15]。而且肺癌給患者家庭帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，開發(fā)有效的低成本肺癌治療方法迫在眉睫[16]。大量研究表明各種植物提取物可用于各類癌癥的治療[17,18]。

細(xì)胞增殖的不受控是各種癌癥的普遍癥狀。越來越多的研究表明植物提取物在抗癌細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著積極作用。據(jù)報(bào)道迷迭香提取物可降低非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖[19]。有研究顯示吉馬酮可抑制乳腺癌細(xì)胞活力[20]。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)吉馬酮可抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖。另外，吉馬酮還可抑制耐阿霉素慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞活力，增強(qiáng)阿霉素對細(xì)胞增殖的抑制作用[22]。本文結(jié)果顯示，低濃度(<20 μmol/L)的吉馬酮不會對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，高濃度(≥20 μmol/L)的吉馬酮會急劇減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力。吉馬酮可降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力，減弱Ki67表達(dá)。

各種癌癥中常常會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的異常，大量數(shù)據(jù)表明植物提取物可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。Yoon等[23]發(fā)現(xiàn)兒茶素-7-O-木糖苷可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)Caspase-6表達(dá)。有數(shù)據(jù)顯示吉馬酮可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期停留在G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高Bax表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)吉馬酮可提高乳腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9表達(dá)[24]。據(jù)報(bào)道吉馬酮可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)Bax表達(dá)，減弱Bcl-2表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示，吉馬酮可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，提高Cleaved Caspase-3蛋白水平。

細(xì)胞侵襲和遷移在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要，越來越多文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物具有抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移的功效。有數(shù)據(jù)顯示桑橙素可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移，減弱MMP-2和MMP-9表達(dá)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)石榴葉提取物可降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移，抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)[26]。

據(jù)報(bào)道丹參醌ⅡA可減弱非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移，降低VEGF表達(dá)[27]。吉馬酮在細(xì)胞侵襲和遷移方面的研究還較少。Lim等[12]發(fā)現(xiàn)吉馬酮可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。本文結(jié)果顯示，吉馬酮可減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移，降低VEGF表達(dá)。

本研究表明，在人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770和A549細(xì)胞中，吉馬酮處理可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞侵襲和遷移，減弱Ki67和VEGF表達(dá)，提高Cleaved Caspase-3蛋白水平。下一步計(jì)劃在體內(nèi)研究吉馬酮對非小細(xì)胞肺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為開發(fā)有效的低成本的肺癌治療方法提供理論依據(jù)。