徐鴻婕 孫勤國(guó)

(武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢430000)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種在育齡婦女中常見(jiàn)的內(nèi)分泌生殖疾病，患者表現(xiàn)為胰島素抵抗、雄激素過(guò)多、持續(xù)無(wú)排卵等，近年的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，確切的病因尚未明確[1]。有研究指出，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞異常地增殖及凋亡可能是PCOS患者多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育的病理基礎(chǔ)[2]。因此，研究影響卵巢顆粒細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制具有重要意義。透明質(zhì)酸合成酶2(Hyaluronan synthetase 2，HAS2)是透明質(zhì)酸(Hyaluronan,HA)的一種異構(gòu)體，其過(guò)表達(dá)可引起透明質(zhì)酸的過(guò)度分泌，有研究資料顯示，在小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中HAS2基因會(huì)伴隨卵丘擴(kuò)張而表達(dá)升高，抑制HAS2可增強(qiáng)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[3,4]。這提示HAS2可能影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。在本研究中首先檢測(cè)了HAS2在PCOS中的表達(dá)，并將干擾HAS2的siRNA轉(zhuǎn)染到PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中，觀察細(xì)胞的增殖及凋亡情況，并研究潛在的分子機(jī)制，以期為PCOS的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco；BCA試劑盒、CCK8試劑盒均購(gòu)自碧云天；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；HAS2、TGF-β1、VEGF、p-NF-κB、p-IκB、cyclin D1和survivin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基；注射用脫氫表雄酮(Dehydroepian drosterone，DHEA)購(gòu)自湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD。

1.2方法

1.2.1PCOS大鼠模型卵巢組織采集 SPF級(jí)雌性SD大鼠購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，21日齡，共30只。將大鼠適應(yīng)性飼喂2 d，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只。PCOS模型建立：大鼠持續(xù)肌肉注射DHEA(6 mg/100 g體重)及注射用油0.2 ml，共注射21 d，對(duì)照組在此期間僅注射0.2 ml的注射用油。注射DHEA第21天，將大鼠禁食12 h后稱重，摘取卵巢組織，備用。

1.2.2Western blot檢測(cè)兩組卵巢組織中HAS2的表達(dá) 卵巢組織中加入適量的裂解液提取組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，取50 μg總蛋白上樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉膜，加入1∶500稀釋的HAS2抗體及1∶1 000 稀釋的內(nèi)參GAPDH抗體，4℃搖床孵育過(guò)夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)，37℃搖床孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光劑顯色，洗片后進(jìn)行顯影和定影。以GAPDH為內(nèi)參，以HAS2與GAPDH的灰度比值作為HAS2的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3卵巢顆粒細(xì)胞的獲取 在雌性大鼠于DHEA干預(yù)21 d后，DHEA誘導(dǎo)大鼠及空白對(duì)照組大鼠分別斷頸處死，獲取卵巢器官。在解剖鏡下用注射器刺破卵巢上的卵泡，使顆粒細(xì)胞釋放出來(lái)。用移液器吸取顆粒細(xì)胞，使用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液清洗3次后，于37℃，5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24 h。

1.2.4分組及siRNA轉(zhuǎn)染 將卵巢顆粒細(xì)胞分為空白組(Control組)、PCOS大鼠模型卵巢顆粒細(xì)胞分成陰性對(duì)照組(NC組)和si-HAS2組。NC組和si-HAS2組分別轉(zhuǎn)染合成的無(wú)干擾作用的siRNA及靶向抑制HAS2的特異性siRNA，轉(zhuǎn)染前24 h以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的數(shù)量將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的卵巢顆粒細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%以上時(shí)，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中HAS2的蛋白表達(dá)。

1.2.5CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力 以每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的卵巢顆粒細(xì)胞于96孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)50%時(shí)，按照上述分組轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后每孔細(xì)胞中加入10 μl CCK8，37℃孵育4 h，450 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種卵巢顆粒細(xì)胞于6孔板的培養(yǎng)皿，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞24 h，按照上述分組轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h，胰酶消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，離心后重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，混勻，避光反應(yīng)1 h內(nèi)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7TGF-β1、VEGF、p-NF-κB、p-IκB、cyclin D1和survivin蛋白表達(dá)檢測(cè) 參照1.2.2方法。

2 結(jié)果

2.1HAS2在PCOS大鼠卵巢組織的表達(dá) 建立PCOS大鼠模型，取出卵巢組織，Western blot檢測(cè)卵巢組織中HAS2蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組及PCOS組卵巢組織中HAS2的蛋白表達(dá)分別為0.069±0.008、0.556±0.043，HAS2在PCOS中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2si-HAS2轉(zhuǎn)染大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的效果 各組轉(zhuǎn)染si-HAS2的細(xì)胞中HAS2的蛋白表達(dá)結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組、NC組及si-HAS2組HAS2的蛋白表達(dá)分別為0.458±0.046、0.471±0.049和0.103±0.011，si-HAS2組HAS2的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而NC組HAS2的表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活力及凋亡的影響 si-HAS2轉(zhuǎn)染大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力及凋亡率的檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，si-HAS2組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖3。

2.4si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞免疫因子表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中免疫抑制因子TGF-β1和VEGF的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表2所示，與NC組比較，si-HAS2組TGF-β1和VEGF的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

2.5si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響 各組細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路p-NF-κB、p-IκBα及下游cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5和表3所示，與NC組比較，si-HAS2組p-NF-κB、p-IκBα、cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

圖1 HAS2在PCOS和對(duì)照大鼠卵巢組織的表達(dá)Fig.1 Expression of HAS2 in ovarian tissue of PCOS and control rats

圖2 si-HAS2轉(zhuǎn)染大鼠卵巢顆粒細(xì)胞后HAS2的蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of HAS2 after transfected si-HAS2 in rat ovarian granulosa cells

表1 si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活力及凋亡的影響

Tab.1 Effect of si-HAS2 transfection on vitality and apoptosis of rat ovarian granulosa cells

Groups ODApoptosis rate(%)Control group0.415±0.0342.45±0.11NC group0.402±0.0312.61±0.18si-HAS2 group0.277±0.0261)18.26±0.671)

Note： Vs NC group，1)P<0.05.

圖3 si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of si-HAS2 transfection on apoptosis of rat ovarian granulosa cells

圖4 si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞免疫因子TGF-β1和VEGF表達(dá)的影響Fig.4 Effect of si-HAS2 transfection on expression of TGF-β1 and VEGF in rat ovarian granulosa cells

表2 si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞免疫因子TGF-β1和VEGF表達(dá)的影響

Tab.2 Effect of si-HAS2 transfection on expression of TGF-β1 and VEGF in rat ovarian granulosa cells

Groups TGF-β1 VEGFControl group0.431±0.0380.311±0.028NC group0.456±0.0420.329±0.030si-HAS2 group0.115±0.0131)0.102±0.0091)

Note： Vs NC group,1)P<0.05.

圖5 si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of si-HAS2 transfection on NF-κB signaling pathway in rat ovarian granulosa cells

表3 si-HAS2轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

Tab.3 Effect of si-HAS2 transfection on NF-κB signaling pathway in rat ovarian granulosa cells

Groupsp-NF-κBp-IκBαcyclinD1survivinControl group0.162±0.0140.141±0.0120.589±0.0580.196±0.023NC group0.154±0.0120.134±0.0110.552±0.0450.211±0.025si-HAS2 group0.077±0.0081)0.059±0.0071)0.187±0.0211)0.145±0.0161)

Note：Vs NC group,1)P<0.05.

3 討論

PCOS的病因較為復(fù)雜，目前也沒(méi)有公認(rèn)的建立PCOS動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)，臨床上多用孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素注射、DHEA肌肉注射等方法[5,6]。在本研究中使用DHEA肌肉注射方法建立PCOS大鼠模型。HA屬于細(xì)胞外基質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)，可通過(guò)與細(xì)胞表面受體互作影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、黏附等細(xì)胞行為[7]。HAS2為HA的一種異構(gòu)體，過(guò)表達(dá)HAS2可引起HA的過(guò)度分泌，HAS2的表達(dá)失控可引起多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8,9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，HAS2表達(dá)會(huì)隨著卵母細(xì)胞成熟而升高[10]。在PCOS中HAS2的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制HAS2可增強(qiáng)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[4]。在本研究中，通過(guò)Western blot檢測(cè)PCOS大鼠模型卵巢組織中HAS2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HAS2在卵巢組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)。這提示HAS2可能影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。由于RNA干擾(RNAi)是一種新的特異性沉默基因表達(dá)的技術(shù)，具有高效特異性，且在基因功能方面應(yīng)用十分廣泛[11,12]。因此，本研究中通過(guò)此技術(shù)沉默PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞HAS2，(發(fā)現(xiàn)HAS2表達(dá)受到抑制后卵巢顆粒細(xì)胞的增殖明顯，VEGF作為卵巢內(nèi)的調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)自分泌和旁分泌途徑調(diào)控人體卵巢血管生成)，多篇文獻(xiàn)報(bào)道VEGF在PCOS患者卵泡中表達(dá)明顯升高，且主要在卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而在健康婦女中表達(dá)無(wú)明顯變化[13,14]。也有研究表明，抑制VEGF可阻礙黃體形成及發(fā)揮功能，這提示在靶向治療PCOS中抑制VEGF可能是一個(gè)有效的途徑[15]。TGF-β1在多種組織器官中廣泛分布，在細(xì)胞的免疫應(yīng)答、增生、分化等過(guò)程中有雙向調(diào)節(jié)作用，作為VEGF的上游因子，可促進(jìn)血管的生長(zhǎng)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1參與調(diào)控PCOS的卵泡發(fā)育及閉鎖[17]。在本研究中抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞HAS2表達(dá)后VEGF和TGF-β1的表達(dá)均顯著降低。這提示HAS2可能通過(guò)抑制VEGF和TGF-β1表達(dá)影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。NF-κB是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥、免疫等過(guò)程，有研究顯示，miR-146a可通過(guò)抑制TRAF6、IRAK1的轉(zhuǎn)錄而使NF-κB的活性受到抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，抑制HAS2在卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)后NF-κB信號(hào)通路中p-NF-κB、p-IκBα及下游cyclin D1和survivin的表達(dá)均明顯降低。cyclin D1是一個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白，在卵巢顆粒細(xì)胞中可通過(guò)下調(diào)cyclin D1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖[19]。survivin是一個(gè)凋亡抑制蛋白，PCOS中survivin的表達(dá)升高[20]。因此，本研究的結(jié)果提示HAS2可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)降低卵巢顆粒細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，PCOS中HAS2高表達(dá)，抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中HAS2表達(dá)可降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與下調(diào)免疫抑制因子TGF-β1和VEGF及NF-κB信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。本研究可能為HAS2在PCOS中的作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。