劉湄漪 陳乃耀 周 葳 崔亞歡 劉 競(jìng) 馮會(huì)超

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，唐山063000)

來(lái)源于原始的髓系祖細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的固有免疫細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫監(jiān)測(cè)和穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵作用[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷、全身感染和慢性疾病的反應(yīng)中發(fā)生局部激活[2]，分泌多種炎癥介質(zhì)，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和NO[3]，參與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)。新近許多研究已經(jīng)將神經(jīng)元損傷歸因于小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而不是直接的神經(jīng)毒性損傷[4]。在炎癥初期，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為促炎型即經(jīng)典活化型 (M1)，分泌多種炎癥因子。急性炎癥后期，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型即旁路活化型(M2)轉(zhuǎn)化，分泌抗炎細(xì)胞因子有助于神經(jīng)保護(hù)[5]。故此，在增強(qiáng)抗炎、促生長(zhǎng)表型的同時(shí)，以抑制促炎表型為目標(biāo)的免疫治療，將會(huì)對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用有很大的益處。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesmalmal stem cells，MSCs)是一類多能細(xì)胞，具有自我更新和潛在的多系特性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的理想細(xì)胞來(lái)源。有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型活化，上調(diào)抗炎介質(zhì)表達(dá)，并增強(qiáng)其吞噬作用[6]，但其機(jī)制尚不清楚。研究表明，MSCs分泌多種生物活性分子，如營(yíng)養(yǎng)因子和抗炎分子，以調(diào)節(jié)宿主的微環(huán)境[7]，MSCs的旁分泌作用可能是其治療作用的主要途徑[8]。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是小膠質(zhì)細(xì)胞的刺激因子，LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在炎癥相關(guān)疾病中起主要作用[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)LPS刺激誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(hUC-MSCs-CM)干預(yù)，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化的表型變化，了解hUC-MSCs-CM是否調(diào)節(jié)M1/M2極化的變化，并且探討其潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 臍帶取自華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并得到家屬同意。MSCs由臍帶組織中分離提取，連續(xù)傳4代以上。BV2 細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 LPS購(gòu)自Sigma；胎牛血清購(gòu)自PAN；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Gibco；雙抗、DMEM(高糖)、IMEM均購(gòu)自CORNING；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、超敏ExPlus ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自ZOMANBIO；PhosSTOP購(gòu)自Roche；BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自MultiSciences；BSA購(gòu)自BOVOGEN；LDS Sample Buffer(5×)購(gòu)自Thermo Fisher；ACTB抗體購(gòu)自ABclonal；CD86抗體購(gòu)自arigo；Arg1抗體購(gòu)自GeneTex；PI3K抗體購(gòu)自BIOSS；HPR標(biāo)記的兔、鼠二抗購(gòu)自KPL公司。

1.2方法

1.2.1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)原代培養(yǎng) 將臍帶組織進(jìn)行酶解和機(jī)械分離，再通過(guò)230和130 微孔的尼龍網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，制備了初級(jí)混合臍帶組織培養(yǎng)物。單細(xì)胞懸液以1×106～10×106個(gè)細(xì)胞/ml在混合有10%FBS 、1%青鏈霉素的IMEM中培養(yǎng)，4～18 h后，沖洗培養(yǎng)物以去除非貼壁細(xì)胞。37℃、5%CO2濕度良好的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)換液、傳代，得到純臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2.2BV2細(xì)胞培養(yǎng) 將BV2細(xì)胞培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中，加入含有10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、濕度良好的條件下生長(zhǎng)，密度達(dá)到80%以上，1∶4 傳代。

1.2.3hUC-MSCs-CM制備 取生長(zhǎng)良好的3～4代hUC-MSCs，以1×106個(gè)/ml濃度接種于細(xì)胞板，24 h細(xì)胞貼壁，更換無(wú)血清IMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，將上清轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，4℃條件下5 000 g離心10 min，以清除細(xì)胞碎片，加入適量的血清及青鏈霉素配成完全條件培養(yǎng)基備用。

1.2.4分組實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)共分4組：空白對(duì)照組(control組)，單純LPS刺激組(LPS組)，單純hUC-MSCs-CM刺激組(MSCs-CM組)，LPS、hUC-MSCs-CM共刺激組(LPS+MSCs-CM組)。選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的BV2細(xì)胞鋪板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁過(guò)夜后，分別給予1 μg/ml LPS和(或)hUC-MSCs-CM刺激24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5流式細(xì)胞學(xué)鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS(pH=7.4)洗滌3次，用CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD11b和HLA-DR(美國(guó)BD)在常溫、黑暗中培養(yǎng)30 min，再用PBS洗滌、懸浮。利用CXP軟件對(duì)20 000細(xì)胞在FC 500(FACSCalibur，BD，USA)上的特異性熒光進(jìn)行分析。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 收集各組24 h培養(yǎng)的細(xì)胞上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照TNF-α、IL-6試劑盒操作步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值測(cè)定，波長(zhǎng)為490 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算TNF-α 和IL-6濃度。

1.2.7Western blot 6孔板中各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用invent提取試劑盒分別提取各組細(xì)胞的總蛋白和膜蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，等量上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。5%BSA封閉2 h，然后與一抗體在4℃下孵育過(guò)夜(抗β-actin 1∶5 000稀釋；抗Arg1 1∶500稀釋；抗CD86 1∶1 000稀釋；抗p-PI3K、PI3K 1∶1 000稀釋)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室溫孵育1 h (抗兔、抗鼠1∶2 000稀釋)，TBST洗膜3次，10 min/次，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)顯影，用Image J軟件(NIH)進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1hUC-MSCs-CM的形態(tài)特征 倒置顯微鏡下hUC-MSCs呈梭形、短桿狀的貼壁細(xì)胞。單個(gè)的細(xì)胞為成纖維狀，折光性強(qiáng)，胞質(zhì)豐富，極性分布，細(xì)胞匯合時(shí)呈平行排列、旋禍狀生長(zhǎng)見(jiàn)圖1。

2.2hUC-MSCs-CM表面標(biāo)志物流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)雙酶序貫法從臍帶組織提取的hUC-MSC均一地表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)記CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD19，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記 CD11b、CD34，不表達(dá)人類白細(xì)胞共同抗原CD45以及MHCⅡ類分子HLA-DR，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征(圖2)。

2.3hUC-MSCs-CM和LPS對(duì)BV2分泌TNF-α和IL-6的影響 與空白對(duì)照組相比，LPS組分泌TNF-α和IL-6明顯增高，LPS+MSCs組與單純LPS組相比TNF-α和IL-6水平明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1 顯微鏡下觀察第三代hUC-MSCs的形態(tài)特征(×100)Fig.1 Microscope morphological characters of third generation hUC-MSCs(×100)

圖2 培養(yǎng)至第二代的hUC-MSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原Fig.2 Cultivated to second generation of hUC-MSCs in FCM instrument testing surface antigen

圖3 BV2細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的變化Fig.3 Changes of TNF-α and IL-6 secreted by BV2 cellsNote: A.Changes of secretory TNF-α level in BV2 cells.n=3.*.P<0.05 vs LPS group;B.Changes of secretory IL-6 level in BV2 cells.n=3.#.P<0.05 vs LPS group.

2.4hUC-MSCs-CM逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的M1和M2表型改變 CD86為活化小膠質(zhì)細(xì)胞M1型特異性標(biāo)志物，與空白對(duì)照組相比，LPS刺激24 h后，CD86表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，但LPS+MSCs聯(lián)合刺激組與單純LPS組相比，CD86表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Arg1為M2型活化小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，Western結(jié)果顯示MSCs組、LPS+MSCs組與空白對(duì)照組相比，Arg1蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

2.5hUC-MSCs-CM對(duì)PI3K信號(hào)通路的影響 Western結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，MSCs組、LPS+MSCs組的PI3K磷酸化水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖4 CD86蛋白表達(dá)水平Fig.4 CD86 protein expression levelNote: n=3.*.P<0.05 vs LPS group.

圖5 Arg1蛋白表達(dá)水平Fig.5 Arg1 protein expression levelNote: n=3.*.P<0.05 vs other groups.

圖6 PI3K蛋白表達(dá)水平Fig.6 PI3K protein expression level Note: n=3.*.P<0.05 vs other groups.

3 討論

在免疫活動(dòng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中主要免疫細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)包括兩種形式：經(jīng)典激活(M1)和旁路激活(M2)亞型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞是一種促炎細(xì)胞狀態(tài)，與炎癥細(xì)胞因子(包括IL-1、TNF-α和iNOS)過(guò)度表達(dá)有關(guān)，而M2極化小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)釋放有益的介質(zhì)，包括IL-4、IL-10和TGF-β，從而使CNS達(dá)到穩(wěn)態(tài)、再生和神經(jīng)保護(hù)作用[10，11]。這些雙重和相反的激活表型決定了腦損傷后炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在顱腦損傷后初始階段，M1促炎作用占主導(dǎo)地位，大量的炎癥因子被釋放出來(lái)。炎癥后期，小膠質(zhì)細(xì)胞表型從M1極化狀態(tài)過(guò)渡到M2型，抑制促炎癥介質(zhì)以及加強(qiáng)組織修復(fù)[12]。然而，慢性炎癥反應(yīng)通常是由于對(duì)促炎過(guò)程無(wú)效地抑制而發(fā)生的。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞從M1向M2的轉(zhuǎn)化可能是治療顱腦損傷的靶點(diǎn)。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可通過(guò)改變小膠質(zhì)細(xì)胞極化而對(duì)神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用，且其作用途徑與MSCs的旁分泌有關(guān)[8]。故我們利用hUC-MSCs-CM研究hUC-MSCs是否以旁分泌的方式調(diào)節(jié)宿主小膠質(zhì)細(xì)胞，并且探討其作用機(jī)制。

ELISA結(jié)果提示，與LPS組相比，LPS+MSCs聯(lián)合刺激組的TNF-α、IL-6等炎性因子分泌明顯減少。Western結(jié)果顯示，LPS+MSCs組CD86的蛋白表達(dá)量明顯低于LPS組，且Arg1蛋白表達(dá)量明顯高于LPS組。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hUC-MSCs可以通過(guò)外分泌的方式，逆轉(zhuǎn)M1標(biāo)記的增加趨勢(shì)，且刺激了M2標(biāo)記的積累，促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞從M1向M2的轉(zhuǎn)化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、糖代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞存活的途徑[13]。此外，PI3K/AKT還調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)和凋亡[14]。PI3K通路在小膠質(zhì)細(xì)胞活化中起主要的抗炎作用。在誘導(dǎo)抗炎和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-10、IL-1Rα和IFN-β等方面發(fā)揮非常重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞中PI3K/AKT通路的激活，可在神經(jīng)炎癥狀態(tài)下起到抗炎作用和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[15]。研究表明，IRF 3基因治療可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型從促炎(M1型)向抗炎(M2型)的轉(zhuǎn)變[16]。因此，我們探討hUC-MSCs促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型向M2型轉(zhuǎn)化是否與PI3K信號(hào)通路的激活有關(guān)。Western結(jié)果顯示MSCs組、LPS+MSCs組的PI3K磷酸化水平較空白對(duì)照組明顯上調(diào)，這與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Arg1蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，因此，我們推測(cè)hUC-MSCs通過(guò)上調(diào)PI3K信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化中起重要作用。

綜上所述，hUC-MSCs可通過(guò)非接觸的方式明顯抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的分泌，如TNF-α、IL-6等。并且驗(yàn)證了hUC-MSCs可改變LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥激活表型，由促炎癥型(M1型)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡酌庖哒{(diào)節(jié)型(M2-型)，這一結(jié)果可能通過(guò)激活PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的。