王 成 郭長磊 李 霞 劉 振 韓明磊 侯永蘭 楊秀麗

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)一科，新鄉(xiāng)453000)

缺血性心臟病經(jīng)常表現(xiàn)為急性心肌梗死，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和心力衰竭的主要原因[1]。未能滿足心臟的氧氣需求通常是缺血性心臟病的直接原因之一?？谷毖煼ǎㄟ^增加心肌供氧和/或降低心肌耗氧量，使用抗心絞痛藥物來緩解或預(yù)防急性缺血發(fā)作，已被證明是缺血性心臟病的一個(gè)非常重要的治療手段。因此，保護(hù)心肌細(xì)胞免受低氧損傷是降低缺血性心臟病風(fēng)險(xiǎn)的合理治療策略之一[2]。氯化鈷(CoCl2)是著名的組織缺氧模擬劑[3]。據(jù)報(bào)道，CoCl2能夠在許多方面模擬低氧反應(yīng)，例如，減少細(xì)胞生存能力，線粒體膜電位消散，激活caspase-3和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。類黃酮是一種天然的多酚類化合物，具有廣泛的生物活性。山奈酚(Kaempferol,KPF，3,4,5,7-四羥黃酮)是一種植物雌激素，結(jié)構(gòu)如圖1所示，是最常見的膳食類黃酮類化合物之一，常見于茶、花椰菜、柚子和其他植物[4]。山奈酚具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性質(zhì)[5-7]。已有研究表明山奈酚可保護(hù)心臟對抗阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性，說明山奈酚的心臟保護(hù)作用[8]。本文旨在研究山奈酚對缺氧H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 山奈酚購自美國Sigma-Aldrich(96353,Sigma)?；瘜W(xué)式：C15H10O6，分子量：286.24，純度>99%，用DMSO配制成1 mol/L的母液，使用時(shí)稀釋至所需濃度。DMEM培養(yǎng)基、FBS和胰蛋白酶購自美國Gibco 公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司。丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：A003-1)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號：A001-1)購自中國南京建城生物工程研究所。BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所?？笲eclin 1、 P62、 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、mTOR和Unc51-like kinase 1(ULK1)抗體購自美國Abcam公司。Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人H9C2細(xì)胞來源于中科院上海生物研究所細(xì)胞庫。H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并放置在37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每2～3 d更換1次，當(dāng)需要收集細(xì)胞時(shí)，用 0.25% 胰蛋白酶消化。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇 5、10、 20 μmol/L的山奈酚進(jìn)行處理。Hoechst染色。

圖1 山奈酚化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Kaempferol

1.2.2缺氧細(xì)胞模型建立和分組 H9C2細(xì)胞接種在96孔板，接種密度為(1.5～1.8)×104/孔或者接種在6孔板，接種密度為(8～10)×105/孔，然后用1 200 μmol/L CoCl2加入培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h 誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧模型。H9C2細(xì)胞分為5組：對照組(H9C2)，模型組(Hypoxia)：1 200 μmol/L CoCl2處理對照組(H9C2)細(xì)胞24 h，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L， KPF 20 μmol/L)：分別用5、10、 20 μmol/L KPF+1 200 μmol/L CoCl2處理細(xì)胞24 h。

1.2.3CCK-8檢測細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞處理后，連續(xù)培養(yǎng)4 d，每天檢測各組待測細(xì)胞的數(shù)量，制成增殖倍數(shù)曲線。首先用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液將待測細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，然后在37℃培養(yǎng)1～4 h，最后在450 nm處檢測吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.4氧化應(yīng)激標(biāo)記物檢測 根據(jù)試劑盒說明書，用MDA測定試劑盒測定細(xì)胞裂解液中MDA的含量；用SOD測定試劑盒測定細(xì)胞裂解液中SOD的含量。液氮研磨腦組織，按說明書進(jìn)行操作。MDA 在532 nm 處測OD值，SOD在550 nm處測OD值。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 根據(jù)Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行操作：消化收集細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml 固定液，固定10 min或更長時(shí)間(可4℃過夜)；去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液；加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min；去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液；滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。

1.2.6Western blot 首先將各組待測細(xì)胞用PBS將清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100℃變性5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對表達(dá)量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復(fù)3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，分析比較處理組與對照組之間增殖倍數(shù)、凋亡率以及蛋白表達(dá)的差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1山奈酚促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞增殖 連續(xù)培養(yǎng)各組(對照組和處理組)H9C2細(xì)胞4 d檢測細(xì)胞增殖倍數(shù)。如圖2所示，與對照組(H9C2)相比，模型組(Hypoxia)細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組(Hypoxia)相比，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L，KPF 20 μmol/L)增殖倍數(shù)依次提高。山奈酚濃度越高，缺氧心肌細(xì)胞增殖倍數(shù)越高(P<0.01)；處理時(shí)間越長，增殖能力越強(qiáng)。說明山奈酚以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)缺氧H9C2細(xì)胞的增殖能力。

2.2山奈酚抑制缺氧心肌細(xì)胞凋亡 為了檢測山奈酚對缺氧H9C2細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡情況。如圖3A所示，致密濃染藍(lán)色光點(diǎn)的斑點(diǎn)即為凋亡細(xì)胞細(xì)胞核，與對照組(H9C2)相比，模型組(Hypoxia)明顯促進(jìn)H9C2細(xì)胞凋亡(P<0.01)；與模型組相比(Hypoxia)，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L，KPF 20 μmol/L)細(xì)胞凋亡率依次降低(圖3B，P<0.01)。如圖3C所示，凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表達(dá)水平隨KPF濃度升高而降低。說明山奈酚以劑量依賴的方式抑制缺氧H9C2細(xì)胞凋亡。

圖2 山奈酚促進(jìn)缺氧H9C2細(xì)胞增殖Fig.2 KPF promoted proliferation of hypoxic H9C2 cellsNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

圖3 山奈酚抑制缺氧H9C2細(xì)胞凋亡

Fig.3 KPF inhibited apoptosis of hypoxic H9C2 cells

Note: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

2.3山奈酚降低缺氧心肌細(xì)胞ROS水平 如圖4所示，與對照組(H9C2)相比，模型組(Hypoxia)SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比(Hypoxia)，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L，KPF 20 μmol/L)血清中SOD活性顯著升高(P<0.01)，MDA水平顯著下降(P<0.01)。證明山奈酚能增加缺氧心肌細(xì)胞SOD活性并降低脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物MDA含量。

圖4 山奈酚降低缺氧H9C2細(xì)胞ROS水平Fig.4 KPF reduced ROS level of hypoxic H9C2 cellsNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

圖5 山奈酚抑制缺氧H9C2細(xì)胞自噬Fig.5 KPF inhibited autophagy of hypoxic H9C2 cellsNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

圖6 山奈酚激活mTOR信號通路Fig.6 KPF activated mTOR pathwayNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

2.4山奈酚抑制缺氧心肌細(xì)胞自噬 檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin 1，p62和LC3的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。CoCl2明顯促進(jìn)Beclin 1、LC3-Ⅱ表達(dá)，抑制p62表達(dá)；山奈酚呈劑量依賴顯著上調(diào)P62蛋白水平，下調(diào)Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平(圖5A)(P<0.01)。P62與自噬呈負(fù)相關(guān)，而Beclin 1和LC3-Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，暗示山奈酚抑制自噬通量。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(圖5B)，說明LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)換為LC3-Ⅱ，同樣暗示證明山奈酚抑制自噬通量。

2.5山奈酚激活mTOR信號通路 為了山奈酚抑制自噬的潛在機(jī)制，本文檢測缺氧相關(guān)通路ULK1和自噬通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達(dá)情況，如圖6所示，山奈酚明顯上調(diào)mTOR蛋白的表達(dá)，下調(diào)ULK1蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴的特點(diǎn)。

3 討論

缺血性心臟病已成為世界范圍內(nèi)的主要死亡原因，每年造成超過700萬人死亡。在缺血性心臟病中，冠狀動脈血管的堵塞會導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷甚至死亡。缺血損傷可降低心肌ATP含量，導(dǎo)致能量應(yīng)激和活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生[9]。缺血使心肌細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致嚴(yán)重或不可逆的心臟損傷[10]。大量的證據(jù)表明，來源于線粒體的過量ROS與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，如動脈粥樣硬化、心肌梗死和心力衰竭[9]。目前證據(jù)表明，CoCl2是一種非常重要的低氧誘導(dǎo)因子[11]。本文研究顯示，CoCl2處理H9C2細(xì)胞24 h細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯降低、凋亡率明顯提高、SOD水平降低和MDA水平增高說明ROS水平也增加，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，驗(yàn)證了CoCl2誘導(dǎo)低氧損傷的潛力。

研究表明，植物源性多酚類非甾體化合物，包括類黃酮和非黃酮類化合物在保護(hù)心臟特征中具有有效的抗氧化性。這些性質(zhì)部分與羥基的取代有關(guān)，這可能直接導(dǎo)致自由基的消失[8]。誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡的主要分子機(jī)制是自由基的過度產(chǎn)生和嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。因此，具有強(qiáng)抗氧化性的化合物可以通過中和多氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激來發(fā)揮作用。山奈酚是最常見的膳食類黃酮之一，在許多組織(包括心臟)中都有抗凋亡、抗氧化和抗炎的作用[12]。本文研究表明山奈酚可以保護(hù)心肌細(xì)胞對抗CoCl2誘導(dǎo)的凋亡，提高SOD活性，清除MDA，降低ROS含量。從上述文獻(xiàn)報(bào)道的機(jī)制來看，山奈酚作為類黃酮家族一員，除了能增加SOD活性，還可能直接參與消除自由基，從而減輕氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡。大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，在衰竭的心肌中，ROS積累是明顯加重[11]。暴露于ROS會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死、纖維化，最終引起心律失常、興奮收縮耦合損傷、心臟重構(gòu)[13]。細(xì)胞凋亡是缺氧心肌細(xì)胞死亡的主要方式[6]。之前研究表明，山奈酚可以通過抑制凋亡保護(hù)心肌細(xì)胞對抗缺氧/復(fù)氧損傷[8]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，山奈酚可以抑制缺氧心肌細(xì)胞凋亡。

自噬是細(xì)胞溶酶體在嚴(yán)格的調(diào)控下的動態(tài)自降解過程，也被認(rèn)為參與了缺血性心臟病[14]。自噬通常在心臟中維持著較低水平，當(dāng)出現(xiàn)ATP衰竭、過度ROS和線粒體功能障礙等環(huán)境應(yīng)激時(shí)自噬通量急劇上升[15]。適度自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活，而過度自噬可加速細(xì)胞死亡[16]。因此，自噬作為治療缺血性心臟病的潛在靶點(diǎn)已引起越來越多的關(guān)注。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對自噬的初始階段至關(guān)重要。ULK1抑制導(dǎo)致早期自噬體結(jié)構(gòu)停滯[17]。自噬抑制最容易的途徑發(fā)生在對mTOR途徑的激活[18]。當(dāng)ULK1蛋白激酶復(fù)合物被抑制時(shí)，ULK1對mTOR途徑抑制作用被解除，mTOR途徑自然被激活，從而抑制細(xì)胞自噬。mTOR信號通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和死亡相關(guān)的多種相關(guān)功能和機(jī)制[19]。心臟mTOR的過表達(dá)，可以對心肌缺血損傷產(chǎn)生心臟保護(hù)作用，并抑制炎癥反應(yīng)[20]。在本研究中，觀察到CoCl2顯著誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)在CoCl2明顯促進(jìn)Beclin 1、LC3-Ⅱ和ULK1表達(dá)，抑制p62和mTOR表達(dá)；而山奈酚以劑量依賴的方式抵消CoCl2誘導(dǎo)的自噬，導(dǎo)致自噬抑制從而發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)功能。

總的來說，本研究揭示了山奈酚在體外對CoCl2誘導(dǎo)的缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用：促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞增殖、抑制缺氧心肌細(xì)胞凋亡、降低ROS水平和抑制自噬。這種保護(hù)作用可能是通過激活mTOR通路來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果闡明了山奈酚治療缺血性心臟病的潛力。