馬 南 鄧婷婷 王 琴 羅州玲 邱居烽 唐曉娟 黃 梅 韋燕琳 李梅華

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，南寧530021)

糖皮質(zhì)激素是一種常見的抗炎藥物，大劑量吸入激素被廣泛應(yīng)用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者管理中，吸入使用糖皮質(zhì)激素可影響基因轉(zhuǎn)錄，減少炎癥因子釋放，最終減少氣道炎癥，逆轉(zhuǎn)氣道高反應(yīng)性[1,2]。煙草煙霧暴露引起的氧化/抗氧化失衡、肺部炎癥是COPD的重要發(fā)病機(jī)制[3-5]，巨噬細(xì)胞在其病變過程中起著重要作用，分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)[6]，其中IL-6是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,直接參與炎癥和損傷，是COPD 發(fā)病中重要的炎癥因子。在穩(wěn)定期COPD患者肺部觀察到IL-6可促進(jìn)自身免疫反應(yīng)[7]。同時(shí)IL-6可促進(jìn)凋亡相關(guān)的小鼠肺氣腫進(jìn)展，在COPD患者臨床觀察中發(fā)現(xiàn)IL-6與肺氣腫進(jìn)展密切相關(guān)[8]。SIRT1是沉默信息調(diào)節(jié)因子1，屬于去乙?；涪蠹易宄蓡T，對(duì)氧化還原敏感，在氧化劑及羥基應(yīng)激作用下出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后修飾，使其在細(xì)胞中的表達(dá)及活性下降[9]。SIRT1與細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)、衰老、凋亡等密切相關(guān)[10,11]，可通過乙?；{(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)參與調(diào)節(jié)慢性炎癥進(jìn)展[12]。由于DEX可通過激活核因子NF-E2相關(guān)因子(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)減少體內(nèi)氧化物產(chǎn)生，從而發(fā)揮一定的抗氧化應(yīng)激作用[13,14]，DEX對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下巨噬細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響及其作用機(jī)制如何，DEX能否通過作用于SIRT1實(shí)現(xiàn)其抗炎作用，目前國內(nèi)外尚缺乏系統(tǒng)研究，因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料 佛波酯(PMA)、Dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA)購自美國Sigma 公司產(chǎn)品；真龍牌香煙(焦油：15 mg，煙堿1.1 mg)購自廣西南寧卷煙廠；地塞米松磷酸鈉注射液(DEX)購自廣西醫(yī)科大制藥廠；IL-6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購自中國武漢華美公司產(chǎn)品；蛋白提取試劑盒為美國Pierce公司產(chǎn)品；NF-κB多克隆抗體、SIRT1多克隆抗體為美國CST 公司產(chǎn)品；人類單核細(xì)胞系細(xì)胞株(U937 細(xì)胞)從中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)在5%CO237℃含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),每周傳代約2～4次。應(yīng)用PMA標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)937 單核細(xì)胞系誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞[7]。將細(xì)胞均勻接種到6 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×106～1×107。加入PMA(10 ng/ml)誘導(dǎo)24 h。24 h 后，丟棄上清液，加入新的培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞分組 用PMA將U937細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，將分化后的人巨噬細(xì)胞分組：對(duì)照組(Control)、煙草煙霧提取物(CSE)組(在分化后的巨噬細(xì)胞中加入1%CSE 孵育24 h)、DEX 組(10-6mol/L DEX預(yù)孵育24 h后，加入1%CSE繼續(xù)孵育24 h)、NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)組(加20 nmol/L PDTC 預(yù)孵育24 h 后，加入1% CSE 繼續(xù)孵育24 h)、SIRT1 特異性抑制劑曲煙酰胺(NAM)組(在分化后的巨噬細(xì)胞中加入NAM 20 mmol/L孵育24 h)。

1.2.3煙草煙霧提取物(CSE)的制作 參照以往CSE的制作方法[8，9]及Se-Ran[10]的改良制作方法，將2 支去過濾嘴燃燒的香煙煙霧由注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸，將煙霧通入20 ml 無血清的培養(yǎng)基中，制成10%的CSE 溶液。將溶液pH 值調(diào)至7.4，過濾，稀釋，使CSE在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中作用于細(xì)胞的最終濃度為1%。溶液1 h 內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4IL-6 檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞孵育到期后，1 000 g 離心3 min收集各組細(xì)胞上清液，檢測(cè)按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)活性氧水平 將誘導(dǎo)分化成功的巨噬細(xì)胞種植于96孔板中(1 000個(gè)/孔)，分組誘導(dǎo)，到期后每個(gè)孔PBS 洗細(xì)胞3 次，應(yīng)用 DCFHDA 為ROS 捕獲劑。以1 μmol/L DCFH 孵育細(xì)胞30 min。以PBS 漂洗3次,上機(jī)檢測(cè)(Microp-late Flurescence reader,BIO-TEK,USA)OD值。

1.2.6蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)SIRT1和NF-κB蛋白表達(dá) 4℃ 0.01 mol/L PBS 洗細(xì)胞3 次，加200 μl蛋白裂解液， 裂解產(chǎn)物在冰上繼續(xù)裂解30 min后12 000 g 離心5 min。取上清測(cè)蛋白質(zhì)量濃度及調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度至3 μg/μl，SDS-PAGE 蛋白緩沖液按照比例混合，煮沸5 min，立即放入冰箱，4℃ 12 000 g離心10 min，取上清分裝，-20 ℃?zhèn)溆?。制?0%SDS-PAGE膠，4℃保存過夜，恢復(fù)至室溫使用，上樣進(jìn)行垂直電泳，用10%SDS-PAGE膠分離，轉(zhuǎn)移到0.45 nm PVDF膜上，PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h 后，用TBST 溶液平衡5 min 再與相應(yīng)一抗在4℃搖床孵育過夜，PVDF膜用TBST 洗6次，每次5 min，加相應(yīng)二抗(1∶10 000)在室溫?fù)u床孵育1 h，再用TBST 洗6次，每次5 min。在暗房?jī)?nèi)用發(fā)光劑發(fā)光，顯影，定影，分析。

2 結(jié)果

2.1DEX對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞釋放IL-6 的影響 與對(duì)照組比較，CSE 組細(xì)胞上清中的IL-6 含量明顯增高(P<0.05)，DEX預(yù)孵育24 h 能明顯抑制CSE 對(duì)細(xì)胞IL-6 的上調(diào)作用。NF-κB 特異性抑制劑PDTC 組細(xì)胞上清中的IL-6 含量受到抑制。SIRT1特異性抑制劑NAM組IL-6水平較之對(duì)照組出現(xiàn)增加(n=5,P<0.01)，見圖1。

2.2DEX對(duì)CSE 刺激的人巨噬細(xì)胞釋放ROS 的影響 與對(duì)照組比較，CSE 刺激引起細(xì)胞中ROS含量明顯增高，DEX預(yù)孵育24 h能明顯抑制CSE刺激細(xì)胞釋放ROS，SIRT1特異性抑制劑NAM可增加ROS釋放(n=6,P<0.01)，見圖2。

圖1 各組細(xì)胞上清液中IL-6含量Fig.1 IL-6 in supernatant of each groupNote: *.P<0.01,compared with the control group;#.P<0.01,compared with the CSE group.

圖2 各組細(xì)胞OD值Fig.2 OD of each groupNote: *.P<0.01,compared with the control group;#.P<0.01,compared with the CSE group.

2.3DEX對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響 如圖3A、B，與對(duì)照組比較，CSE 可以明顯抑制SIRT1的表達(dá)，DEX預(yù)孵育24 h可降低CSE 對(duì)SIRT1 的抑制作用。作為陰性對(duì)照組，SIRT1特異性抑制劑NAM 組的SIRT1表達(dá)明顯被抑制(n=3,P<0.01)。

2.4DEX對(duì)CSE 刺激的人巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的影響 如圖4A、B所示，與對(duì)照組比較，CSE 可以明顯增強(qiáng)NF-κB 的表達(dá)，DEX預(yù)孵育24 h可抑制CSE 對(duì)NF-κB 的激活作用。作為陰性對(duì)照組，NF-κB 特異性抑制劑PDTC 組的NF-κB 表達(dá)明顯被抑制。同時(shí)觀察到SIRT1特異性抑制劑NAM組中NF-κB 表達(dá)較對(duì)照組出現(xiàn)增加(n=3,P<0.01)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot detect expression of SIRT1 protein in cells of each groupNote: A.Western blot analysis for SIRT1 protein expression in the cells of each group;B.The expression of SIRT1 protein compared with each group;*.P<0.01,compared with the control group;#.P<0.01,compared with the CSE group.

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detect expression of NF-κB protein in cells of each groupNote: A.Western blot analysis for NF-κB protein expression in the cells of each group；B.The expression of NF-κB protein compared with each group；*.P<0.01,compared with the control group;#.P<0.01,compared with the CSE group.

3 討論

煙草煙霧含有多種有害成分，引起內(nèi)源性抗氧化基因受損，并導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生內(nèi)源性ROS[3,15,16]，細(xì)胞內(nèi)ROS可引起氧化應(yīng)激，從而損壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)[3,17]，ROS通過激活NF-κB、P38等炎癥通路，使相關(guān)炎癥因子釋放增加[3,15]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)CSE刺激后，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平上升，而DEX處理可抑制CSE引起的ROS釋放，其具體作用機(jī)制可能是DEX通過抑制Nrf2產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物的生產(chǎn)[13,14]。SIRT1特異性抑制劑NAM組ROS水平明顯升高，因?yàn)镾IRT1受抑制后可抑制下游的SIRT3，增加線粒體釋放的細(xì)胞內(nèi)源性ROS[18]，我們考慮SIRT1存在一定抑制氧化應(yīng)激的作用，但是其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。我們的研究顯示NF-κB 抑制劑PDTC亦可減少ROS釋放，其機(jī)制可能是通過抑制鈣調(diào)磷酸酶活性調(diào)節(jié)劑1的釋放[19]。

SIRT1一種NAD依賴性組蛋白去乙?；?，是目前HDACⅢ中研究較多的一個(gè)[12]。SIRT1廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種通路，如炎癥、凋亡、衰老、代謝等[11]。本研究結(jié)果表明，煙草煙霧引起人巨噬細(xì)胞SIRT1 蛋白表達(dá)水平下降。SIRT1在受到氧化應(yīng)激后會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后修飾，同時(shí)煙草煙霧引起的氧化應(yīng)激能促進(jìn)SIRT1依賴的NAD+損失[20]，導(dǎo)致SIRT1受損。在COPD患者及煙草煙霧暴露大鼠肺組織中SIRT1表達(dá)水平下降，同時(shí)提示SIRT1表達(dá)下降與COPD的病情進(jìn)展相關(guān)[21,22]。同時(shí)我們觀察到CSE可促進(jìn)人巨噬細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)，在使用SIRT1抑制劑NAM組中也觀察到NF-κB表達(dá)增加，間接提示人巨噬細(xì)胞中煙草煙霧誘導(dǎo)NF-κB 表達(dá)增強(qiáng)受SIRT1 調(diào)節(jié)。SIRT1與NF-κB中RelA/p65亞基交互作用，通過對(duì)RelA/p65上的賴氨酸310去乙?；种芅F-κB轉(zhuǎn)錄，減少NF-κB表達(dá)，最終調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[23,24]。Rajendrasozhan等[21]在吸煙者及COPD患者肺組織中觀察到SIRT1表達(dá)減少會(huì)引起NF-κB去乙酰化增加，抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而增加NF-κB相關(guān)前炎癥因子轉(zhuǎn)錄[21]。進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6含量，CSE、NAM組中均檢測(cè)到IL-6釋放增加，提示抑制SIRT1可引起與NF-κB相關(guān)的IL-6釋放增加，SIRT1參與調(diào)控NF-κB相關(guān)炎癥因子IL-6釋放。在慢性炎癥中，SIRT1蛋白表達(dá)增加能促進(jìn)NF-κB去乙?；档推滢D(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低相關(guān)前炎癥因子轉(zhuǎn)錄[23,25]。在小鼠肺組織、吸煙者、COPD患者巨噬細(xì)胞中均可檢測(cè)到SIRT1能通過抑制NF-κB降低相關(guān)炎癥因子表達(dá)[12,21]。

糖皮質(zhì)激素是治療COPD的常用藥物，糖皮質(zhì)激素可抑制氣道炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子釋放。我們研究結(jié)果同時(shí)顯示，DEX抑制CSE引起巨噬細(xì)胞釋放活性氧，減輕CSE導(dǎo)致的SIRT1 蛋白表達(dá)下降，進(jìn)而抑制CSE導(dǎo)致的NF-κB 表達(dá)增強(qiáng)，最終減少NF-κB相關(guān)的IL-6釋放。SIRT1是一種對(duì)氧化還原敏感的去乙?；?，在氧化劑及羥基應(yīng)激作用下出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后修飾，使得其在細(xì)胞中的表達(dá)下降[9,20]，如果使用白藜蘆醇抑制氧化應(yīng)激作用，則可以上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)[9,12,26]。EX能抑制氧化產(chǎn)物釋放[13,14]，通過抑制CSE引起的ROS釋放從而降低CSE對(duì)SIRT1的損害，從而降低CSE對(duì)SIRT1的損害，之前的研究已經(jīng)顯示：使用SIRT1激活劑白藜蘆醇能抑制NF-κB表達(dá)，進(jìn)而減少相關(guān)炎癥因子釋放[12,26]。因此，我們推測(cè)DEX是通過增加SIRT1 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)SIRT1對(duì)NF-κB的去乙?；饔迷黾覽12]，減少乙?；疦F-κB 的表達(dá)，從而減少炎癥介質(zhì)IL-6 釋放。

綜上所述， DEX對(duì)煙草煙霧刺激下人巨噬細(xì)胞SIRT1蛋白的影響主要是促進(jìn)SIRT1蛋白表達(dá)，其機(jī)制可能是通過抑制煙草煙霧暴露引起的ROS釋放，從而抑制NF-кB蛋白表達(dá)，最終減少與NF-кB相關(guān)的IL-6 釋放，這可能是DEX抑制煙草煙霧誘導(dǎo)的炎癥的分子機(jī)制之一，為糖皮質(zhì)激素臨床治療吸煙引起的COPD提供了相關(guān)理論依據(jù)。