潘少香，閆新煥，譚夢男，劉雪梅，孟曉萌，鄭曉冬，李志成，曹寧

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014）

藍莓（Blueberry）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.），多年生落葉或常綠灌木小漿果，原產于北美[1-3]。藍莓是越橘屬植物中營養(yǎng)成分最豐富的種類，除含常規(guī)的有機酸、糖以外，還富含維生素A、E、B 以及多種微量元素，并且富含多種黃酮類、花色苷、多酚類化合物等成分，具有抗氧化活性、抗癌、降低膽固醇、延緩衰老等多種藥理活性[4,5]。以藍莓為代表的漿果類水果有“黃金水果”的美譽，但由于產量低、保鮮難度和成本較高，主要以加工為主，鮮食不足50%[6]。目前，藍莓多被加工成果汁、濃縮果汁、果醬等。國內果汁行業(yè)正以平均每年20%的增長率增長，成為食品方面發(fā)展最快的產業(yè)[7]，漿果汁及其復合飲料市場份額不斷增長，形成了新的果汁消費市場。近年來，國內各大果汁飲料廠開始重視漿果果汁的生產，但由于產量低、成本高，漿果果汁摻假、造假、錯誤標簽等導致的食品質量和安全爭議不斷發(fā)生，果汁真?zhèn)舞b別技術面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，常用的漿果真?zhèn)螜z測方法，一是基因技術，利用PCR 技術對果汁中未知物進行鑒偽篩查[8-10]；二是同位素分析法，利用質譜或核磁技術對果汁中C、H、O 等同位素特征比例精確測定外源添加物含量[11-13]。這些方法在漿果果汁鑒定上有一定的準確性，但過程相對繁瑣，不易實現，尤其是測定多品種混合的果汁，方法的準確性、靈敏度和檢測范圍將會受到很大限制。市售漿果果汁飲品售價高昂且質量參差不齊，消費者又很難通過簡單的感官判斷加以鑒別，而現行分析檢測技術方法無法完全滿足上述要求。因此，亟需一種快捷、可靠的漿果果汁摻偽識別技術。

近年來，特征性化學成分的識別是漿果及其果汁檢測中興起的一個熱點。通過特征成分檢測或建立特征成分指紋圖譜來進行果汁鑒偽的研究較多，但由于果汁中化合物天然含量較低和廣泛的物種變異性，效果不理想。藍莓中花色苷種類多，含量高[14,15]，在特征成分指紋圖譜鑒偽方面有很大的優(yōu)勢，本研究針對市售藍莓汁中經常使用樹莓汁、石榴汁、葡萄汁等進行以次充好現象，利用液相色譜技術，結合化學計量學統(tǒng)計分析方法，建立了藍莓汁中花色苷的快速高效指紋圖譜鑒偽技術，為藍莓果汁的質量控制提供一種有效的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮的藍莓、石榴、樹莓樣品，均購買于濟南歷下大潤發(fā)超市。

乙腈為色譜純，Thermo fisher USA；甲酸為色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；實驗用水均為超純水，18.2 MΩ。

1.2 儀器與設備

U3000 反相高效液相色譜儀（Thermo fisher，USA），包括自動進樣器、柱溫箱和DAD 檢測器；明澈D24 UV超純水儀，美國Millipore；破壁料理機，九陽JYL-Y15；KQ-500E 超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 供試品制備

為保證果汁的真實性，試驗所用藍莓汁、石榴汁和樹莓汁均由實驗室自制，將藍莓、樹莓分別放入破壁料理機中打漿，漿體直接壓榨取汁。石榴汁由石榴籽粒直接壓榨取汁制得。將純果汁和水1：2 稀釋混勻后，以5000 r/min 轉速離心10 min，過0.45 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 藍莓汁花色苷檢測方法優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

液相流動相選擇甲酸/水和乙腈，經試驗優(yōu)化后液相色譜條件如下：選用AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相A，10%甲酸/水；流動相B，水：甲酸：乙腈=4：1：5；紫外線檢測波長530 nm；流速為1 mL/min；柱溫40 ℃。液相色譜洗脫條件采用梯度洗脫（見下頁表1），優(yōu)化后藍莓汁花色苷色譜圖如圖1（見下頁）所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

圖1 藍莓汁花色苷色譜圖Fig.1 Anthocyanin chromatogram of blueberry juice

從圖1 中可以看出，藍莓汁花色苷存在7 個色譜峰，分 別 出 現 在 9.370、16.383、18.653、19.237、20.558、21.310、23.693 min 處。7 種花色苷能夠明顯分開，該方法的分離度較好。

2.1.2 花色苷檢測方法學考察

（1）精密度

同一藍莓汁樣品，連續(xù)檢測6 次，記錄上述7 種花色苷色譜圖峰面積，計算各成分峰面積的RSD，由于精密度和穩(wěn)定性的檢測方法相同，且精密度對進樣時間沒有要求，因此精密度和穩(wěn)定性使用同一組數據，結果見表2，花色苷的RSD 均小于1.5%，精密度良好。

（2）穩(wěn)定性

取藍莓汁供試樣，按上述色譜方法，每隔2 h 進一針，連續(xù)檢測6 次，記錄上述7 種花色苷色譜圖峰面積，計算各成分峰面積的RSD，結果見表2。從表2 中可以看出，7 種花色苷的RSD 均小于1.5%，說明花色苷供試溶液在10 h 內穩(wěn)定性良好。

（3）重復性

按1.3 項中的方法制備6 個藍莓樣品溶液，在上述色譜條件下分別進樣測定，測試結果見表3。從表3 可以看 出， 樣 品 中 9.370、16.383、18.653、19.237、20.558、21.310、23.693 min 處的色譜峰面積RSD 分別為2.8%、2.8%、3.2%、5.7%、1.5%、4.7%、2.9%。7 個色譜峰的峰面積RSD 均在6%以內，說明該方法的重復性良好。

2.2 常見摻假果汁指紋圖譜色譜峰比對

將藍莓汁中常見的摻假果汁石榴汁和樹莓汁按照上述樣品處理和檢測方法操作，比較三種樣品花色苷色譜圖，結果見圖2。

從圖2 中可以看出，石榴汁中花色苷數量只有4 種，分別出現在5.93、8.657、11.923、12.757 min 處，樹莓汁中峰形較明顯的花色苷有5 種，分別出現在11.223、12.867、18.243、19.700、23.283 min 處。比較藍莓汁、石榴汁、樹莓汁三種果汁花色苷色譜圖可以發(fā)現，每種果汁花色苷色譜圖出峰時間及峰面積各不相同，均具有特異性。

表2 方法精密度和穩(wěn)定性Table 2 Method precision and stability

表3 方法重復性Table 3 Method repeatability

圖2 藍莓汁、石榴汁和樹莓汁的花色苷液相色譜圖Fig.2 Anthocyanin liquid chromatogram of blueberry juice,pomegranate juiceand raspberry juice

2.3基于化學計量學方法的花色苷指紋圖譜數據分析

2.3.1 花色苷指紋圖譜數據化

利用上述方法檢測藍莓、石榴、樹莓供試液中的花色苷，每個樣品重復一次，記錄花色苷的出峰時間和峰面積，結果見表4（見下頁）。將花色苷指紋圖譜數據化，便于進一步結合計量學方法進行分析，能夠更加直觀地反映出不同樣品花色苷的差異。

從表4 中可以看出，藍莓、石榴、樹莓三種樣品的花色苷品種和含量各不相同。從藍莓、石榴、樹莓三種樣品中共檢測出16 種花色苷，為了更加直觀地反應三種樣品的差異，采用降維分析法中的主成分分析法以及聚類分析法對三種樣品做進一步的分析。

2.3.2 花色苷指紋數據主成分分析

采用SPSS 25.0 對不同樣品不同保留時間的花色苷峰面積做主成分分析，選取兩個主成分，主成分的特征向量和載荷見表5（見下頁）。

從表5 中可以看出，第一主成分中貢獻率比較大的成分是保留時間為9.76、16.383、18.653、19.237、23.693 min 處的色譜峰，這5 種色譜峰在藍莓汁中出現，未在石榴汁和樹莓汁中出現，是藍莓汁的特征花色苷峰，這說明第一主成分主要反映的是藍莓汁花色苷的變異信息。石榴汁和樹莓汁花色苷色譜峰在第二主成分有較高的響應，說明這一主成分主要反映的是石榴汁和樹莓汁花色苷的變異信息。以第一主成分值為橫坐標，第二主成分值為縱坐標做散點圖（見第11 頁圖3）。第一、第二主成分綜合貢獻率達到95%，說明前兩個主成分基本上可以解釋大部分花色苷含量的變異信息。從主成分分析圖中可以看出，不同樣品在主成分分析圖中能夠明顯的分開，且根據品種劃分為三個區(qū)域分布在不同的象限中，說明三個品種的果汁中花色苷種類和含量存在顯著的差異。

表4 藍莓汁、石榴汁、樹莓汁花色苷保留時間及峰面積Table 4 Retention time and peak area of anthocyanin in blueberry juice, pomegranate juice and raspberry juice

表5 2 個主成分的特征向量和載荷Table 5 Principal component eigenvectors and loading matrix

圖3 三種果汁主成分散點圖Fig.3 PCA biplot of three juice

2.3.3 花色苷指紋圖譜數據聚類分析

采用SPSS 25.0 對不同樣品不同保留時間的花色苷峰面積做聚類分析，聚類分析結果見圖4。從聚類樹狀圖中可以看出，藍莓、石榴、樹莓樣品能夠明顯的分為三類，每個品種自動聚為一類，說明三種樣品的花色苷指標存在明顯的差距。同時從聚類分析圖中可以看出藍莓汁色譜圖與石榴汁和樹莓汁的間距都比較大，這說明藍莓汁花色苷指紋圖譜的特異性較大。

圖4 三種果汁聚類分析樹狀圖Fig.4 The cluster analysis diagram of three kinds of fruit juice

3 討論

3.1 藍莓汁花色苷提取方法的選擇

為提高花色苷的提取率，一般采用有機試劑乙醇、甲醇等對樣品進行提取[14,16]，本實驗研究目的在于鑒偽，無需考慮樣品中花色苷具體含量的高低，因此選擇將樣品直接稀釋過濾上機，這樣可以避免樣品在提取過程中造成的差異，同時避免提取物質雜峰對鑒偽花色苷成分的干擾。

3.2 藍莓花色苷指紋圖譜檢測方法的建立

本試驗建立的藍莓花色苷指紋圖譜檢測方法穩(wěn)定性、重復性和精密度良好，能夠檢測出藍莓汁中特征花色苷成分，并且分離度良好，同時對石榴汁和樹莓汁樣品進行了檢測，也能夠檢出并分離開石榴汁和樹莓汁樣品中的花色苷成分，這充分說明了藍莓花色苷指紋圖譜檢測方法的有效性。

3.3 不同果汁指紋圖譜色譜峰比對

對藍莓汁、石榴汁和樹莓汁三種果汁的花色苷指紋譜圖和數據進行了比對，并利用分析軟件進行了主成分分析和聚類分析，聚類分析結果與主成分分析結果相符，結果表明三種果汁的花色苷指紋圖譜具有較大的差異性，能夠得到明顯的區(qū)分，這說明不同樣品花色苷真實性評價是可行的，花色苷指紋圖譜可以作為藍莓汁真?zhèn)舞b別的依據。