史佳民， 劉 娣， 范理宏

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166； 2. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院呼吸科，上海 200072；3. 同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院胸外科，上海 200433)

隨著民眾健康意識的提高和低劑量螺旋CT的逐漸普及，肺部結(jié)節(jié)的檢出率大幅提高。肺結(jié)節(jié)是影像學(xué)上直徑<3cm的圓形或類圓形病灶，可單發(fā)或多發(fā)，病理上分為良性(如鈣化、錯構(gòu)瘤等)與惡性(如腺癌、鱗癌等)兩大類[1]。但是肺結(jié)節(jié)尤其是肺小結(jié)節(jié)缺乏有效的診斷手段。目前用于診斷肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的手段包括支氣管鏡、肺穿刺活檢等[2]，一方面陽性診斷率不高，另一方面均是有創(chuàng)手段，增加了患者的經(jīng)濟及心理負(fù)擔(dān)。

近年來，大量研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[3]，如抑制或促進腫瘤生長發(fā)展。本課題組已對非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)病例與健康人[4]及良性肺疾病[5]病例的血漿miRNA表達(dá)譜進行了分析，篩選出了具有診斷價值的miRNA[6]。本研究基于以上結(jié)果，檢測270例早期NSCLS和327例肺部良性結(jié)節(jié)7種循環(huán)血miRNA的表達(dá)水平，進一步驗證其鑒別良惡性肺結(jié)節(jié)的價值，并篩出靈敏度、特異度最高的指標(biāo)，以輔助診斷早期NSCLS。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有入組患者血樣與臨床資料均于2017年3—5月收集于同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院。病例采集于胸外科、呼吸內(nèi)科和腫瘤科所有擬行手術(shù)且影像學(xué)上最大直徑≤30mm的肺結(jié)節(jié)患者，共800例，于術(shù)前1周采集血樣。入選標(biāo)準(zhǔn)： (1) 病理診斷明確；(2) 結(jié)節(jié)直徑≤30mm；(3) 入組TNM分期為T1N0M0；(4) 無其他腫瘤病史；(5) 術(shù)前未進行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)： (1) 拒絕參與研究者；(2) 病理為不典型增生或混合小細(xì)胞肺癌者；(3) 合并急性感染、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等。據(jù)病理結(jié)果符合入組標(biāo)準(zhǔn)者共597例，其中270例NSCLS患者，327例良性結(jié)節(jié)患者。NSCLS組中腺癌200例，鱗癌70例。良性結(jié)節(jié)組中錯構(gòu)瘤2例，肉芽腫49例，炎性假瘤103例，纖維增生74例，其他99例。NSCLS組和良性結(jié)節(jié)組樣本在年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，性別差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。本研究獲得同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗步驟

患者晨起空腹采集5mL全血，4℃，3000r/min，離心15min(離心半徑5.8cm)，提取血漿，-80℃冰箱保存。本研究使用miRNeasy Serum/Plasma kit RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，按照使用說明，從200μL的患者血漿中提出14μL總RNA，然后使用NanoDrop 2000微量分光光度計測定濃度與純度。使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海灝勤生物公司)反轉(zhuǎn)錄得到20μL cDNA(反應(yīng)體系： 總RNA 5μL，反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNTP 4μL，特定緩沖液4μL，莖環(huán)引物1μL，最后加RNase-Free，將總體積補至20μL)。然后使用Eppendorf MCpro進行反轉(zhuǎn)錄(42℃孵育40min，70℃孵育15min)。接著使用miRNA熒光定量檢測試劑盒(上海灝勤生物公司)進行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR(反應(yīng)體系： cDNA 1μL，探針和引物預(yù)混液1μL，緩沖液10μL，最后加RNase-Free，將總體積補至20μL)。最后使用ABI 7900實時熒光定量PCR以95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s進行45個循環(huán)來擴增。

采用相對定量法(以GAPDH為內(nèi)參)對患者血漿中7種miRNA(miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p)含量進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miRNAs及兩兩差值表達(dá)

13組miRNA(miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-92a-3p、miR16-17、miR16-19、miR16-20、miR19-92、miR20-92、miR17-92、miR15-16、miR15-92、miR92-146、miR16-146)在NSCLS組表達(dá)與良性結(jié)節(jié)組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其余表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

2.2 NSCLS與良性結(jié)節(jié)的診斷試驗

將上述13組在NSCLS組與良性結(jié)節(jié)組中有顯著表達(dá)差異的miRNA進行靈敏度與特異性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與良性結(jié)節(jié)組比較，miR16-20、miR16-19、miR20-92對NSCLS的診斷價值位居所有指標(biāo)的前3位，見表2。

2.3 NSCLS與良性結(jié)節(jié)的診斷試驗的單、多因素Logistics回歸結(jié)果

進一步將7組miRNAs進行單因素與多因素Logistics回歸分析，結(jié)果顯示在校正年齡、性別因素后，miR-15b-5p(OR=2.17)、miR-16-5p(OR=2.33)、miR-17-5p(OR=5.68)、miR-19a-3p(OR=3.04)、miR-146b-3p(OR=2.95)與NSCLS存在顯著的關(guān)聯(lián)(P<0.05)。miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p的表達(dá)量越低，NSCLS風(fēng)險越大；miR-15b-5p、miR-146b-3p的表達(dá)量越高，NSCLS風(fēng)險越大。見表3。

2.4 miRNAs聯(lián)合診斷

聯(lián)合位居NSCLS診斷價值前3位的miR16-19、miR16-20、miR20-92進行分析。根據(jù)ROC曲線，miR16-20的AUC最高為0.71，說明其診斷價值最高。miR16-20/miR16-19、miR16-20/miR16-19/miR20-92聯(lián)合診斷均能提高靈敏度(81.8%、86.2%)，可輔助NSCLC的早期臨床篩查。miR16-20+miR16-19、miR16-20+miR16-19+miR20-92聯(lián)合診斷均提高診斷特異度(84.3%、 92.8%)，可輔助可疑肺結(jié)節(jié)的確診，見表4。

表1 NSCLS與良性結(jié)節(jié)的基線信息比較

因素NSCLS(n=270)良性結(jié)節(jié)(n=327)χ2/tP性別8.790.003 男135(50.0%)203(62.1%) 女135(50.0%)124(37.9%)年齡/歲59.01±11.5657.59±15.521.270.204miR1629.28±2.8027.92±3.195.55<0.001miR9230.27±3.2428.89±3.115.18<0.001miR1531.98±2.8431.49±2.122.350.019miR16-17-2.56±3.17-3.62±1.964.51<0.001miR16-19-3.62±1.88-4.63±2.016.19<0.001miR16-20-3.62±2.15-4.73±1.996.37<0.001miR19-922.78±2.443.54±2.01-3.98<0.001miR20-922.69±3.193.80±2.55-4.53<0.001miR17-921.75±2.782.51±2.08-3.460.001miR15-162.70±3.303.57±3.57-3.070.002miR15-921.70±3.892.61±3.57-2.920.004miR92-146-5.70±3.29-6.42±3.712.410.016miR16-146-6.50±3.78-7.27±4.462.160.031

僅列出兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的miRNA

表2 NSCLS與良性結(jié)節(jié)的診斷試驗結(jié)果

(續(xù)表2)

僅列出兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的miRNA

表3 NSCLS與良性結(jié)節(jié)的單、多因素Logistics回歸分析結(jié)果

#為男比女；$為連續(xù)變量；a為低比高；b為高比低；B： 回歸系數(shù)；SE： 標(biāo)準(zhǔn)誤；OR： 比值比

表4 聯(lián)合診斷分析結(jié)果

a: miR16-20和miR16-19；b: miR16-20和miR16-19和miR20-92;c: miR16-20或miR16-19;d: miR16-20或miR16-19或miR20-92

3 討 論

低劑量螺旋CT的普及大大提高了肺結(jié)節(jié)的檢出率。由于肺結(jié)核、肺炎、肺膿腫、炎性假瘤等多種良性疾病與肺癌影像學(xué)上均可表現(xiàn)為圓形或類似圓形病灶，導(dǎo)致臨床上肺結(jié)節(jié)的性質(zhì)很難被確診。胸部CT僅可篩出肺結(jié)節(jié)，根據(jù)影像學(xué)形態(tài)推測其性質(zhì)，并不能診斷其性質(zhì)。目前用于診斷肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的方式包括支氣管鏡、肺穿刺活檢等，陽性診斷率不高且均為有創(chuàng)手段，增加了患者的經(jīng)濟及心理負(fù)擔(dān)。

本研究驗證了外周循環(huán)血中的miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p對良惡性肺結(jié)節(jié)具有鑒別診斷價值，即miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p的表達(dá)量越低，NSCLS風(fēng)險越大；miR-15b-5p、miR-146b-3p的表達(dá)量越高，NSCLS風(fēng)險越大。并進一步進行差值法分析，篩出了miR-16-5p與miR-20a-5p的差值即miR16-20是最具輔助診斷早期NSCLS價值的指標(biāo)(AUC： 0.71，靈敏度： 77.3%，特異性： 65.4%)。另外，對位居NSCLS診斷價值前3位的miR16-19、miR16-20、miR20-92進行聯(lián)合診斷分析，結(jié)果顯示：miR16-20/miR16-19、miR16-20/miR16-19/miR20-92聯(lián)合診斷均能提高靈敏度，可輔助NSCLC的早期臨床篩查。miR16-20+miR16-19、miR16-20+miR16-19+miR20-92聯(lián)合診斷均提高診斷特異度，使輔助可疑肺結(jié)節(jié)的確診成為可能。

既往國內(nèi)外已有大量研究表明miRNA表達(dá)差異與肺癌有高度相關(guān)性[7-8]。例如Zhang等[9]收集患者肺腫瘤組織和相鄰的非腫瘤組織進行miRNA和mRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)7種可用于診斷肺癌的miRNA(miR-205-5p、miR-3917、miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p，AUC分別為0.73、0.66、0.64、0.76、0.77、0.73、0.78)；從AUC來看，診斷價值有高于本研究的miR16-20(AUC為0.71)，也有低的，但總體來說，腫瘤組織及癌旁組織miRNA的診斷價值可能高于外周血miRNA。Leidinger等[10]通過高通量qRT-PCR和微陣列分析發(fā)現(xiàn)33種miRNA在NSCLS患者外周血中的表達(dá)與COPD患者外周血中的表達(dá)存在明顯差異，用于兩種人群間的鑒別診斷的AUC為0.91，特異性為88.3%，靈敏度為86.9%。該研究miRNA種類繁多，雖然診斷價值高，但臨床可行性有待探究。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA替代療法，即恢復(fù)或下調(diào)特定miRNA的表達(dá)水平，從而恢復(fù)喪失的腫瘤抑制基因功能。Markou等[11]發(fā)現(xiàn)MRX34是第一個用于miRNA替代療法的脂質(zhì)體，通過靜脈注射可產(chǎn)生miR-34模擬物，可用于無法切除的原發(fā)性肝癌或肝臟受累的實體癌癥患者，該藥物已經(jīng)進入人體臨床試驗期。另外，miR-21抑制劑也被發(fā)現(xiàn)并用于肝細(xì)胞癌的治療；同時，研究發(fā)現(xiàn)miR-21抑制劑抑制了NSCLS異種移植模型中瘤體的生長，說明miR-21可能具有潛在的抗NSCLS的治療價值。

本研究是一項前瞻性研究，相較于一般的回顧性研究，有統(tǒng)一的入組及診斷標(biāo)準(zhǔn)、檢測標(biāo)準(zhǔn)和評判標(biāo)準(zhǔn)，使研究結(jié)果更客觀。同時本研究樣本量大，并運用多種統(tǒng)計學(xué)方法進行分析，研究結(jié)果更加全面。另外，外周循環(huán)血miRNA不僅取材簡便，適用于各類型患者，無特殊禁忌，而且靈敏度與特異性也較高。但本研究是一項非隨機對照的單中心研究，證據(jù)級別有待提高，需更大規(guī)模的、多中心的病例來驗證結(jié)論。

本研究發(fā)現(xiàn)外周血中7種miRNA(miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p)在良惡性肺結(jié)節(jié)的診斷中有較高的靈敏度和特異度。如果能進一步提高檢測方法的靈敏度與特異性，這7種miRNA將來可能成為輔助診斷早期NSCLS可靠的生物標(biāo)記物。