宋影春， 郁霞青， 李 丹

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200072)

甲狀腺癌是一種多階段、多因素的疾病，包括遺傳易感性、生活方式、環(huán)境因素等[1-2]，尚未發(fā)現(xiàn)哪種機(jī)制在抗腫瘤作用中占主導(dǎo)。微生態(tài)學(xué)研究認(rèn)為，生命的本質(zhì)是生物與其環(huán)境形成的生態(tài)平衡，而疾病的本質(zhì)是神經(jīng)-內(nèi)分泌-代謝-微生物-免疫交叉網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中的生態(tài)失調(diào)[3]。近年來，腸道微生物群落成為新的研究熱門。研究發(fā)現(xiàn)，基本所有慢性疾病的進(jìn)程都與腸道微生物密切相關(guān)，包括代謝性疾病、自身免疫病甚至腫瘤[1-5]。乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)與代謝紊亂、自身免疫異常等密不可分。目前仍未有研究探索PTC與腸道微生物群落之間的關(guān)系。

人體有70%以上的黏膜免疫發(fā)生在腸道，通過復(fù)雜的免疫機(jī)制，腸道微生物群落與全身各器官發(fā)生緊密聯(lián)系，其分布、產(chǎn)物及功能代謝通過調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)甚至分子信號通路從而產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[6]。從組織胚胎學(xué)看，甲狀腺和甲狀旁腺由原始消化管的前腸分化而來，提示甲狀腺與腸道組織胚胎發(fā)育的同源性，表明了其與腸道菌群微生態(tài)失衡具有相似的病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

目前，已有少量研究[7-8]初步報道了腸道微生物在自身免疫性甲狀腺炎和甲亢中的作用；然而，PTC作為甲狀腺疾病中最常見的惡性腫瘤，對于探究其發(fā)病過程中腸道微生態(tài)的研究仍無跡可求。本研究提出了假設(shè)，推測腸道微生物群落也與甲狀腺癌病程息息相關(guān)；嘗試性地探索了腸道微生物群落在甲狀腺癌的特定病程中的變化，并與正常健康人群比較，希望能夠?qū)TC相關(guān)腸道微生物群落的變化有新的認(rèn)知。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

于2017年1—6月在同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科住院病區(qū)，收集64例PTC甲狀腺切除術(shù)后擬行131I清甲治療的住院患者的糞便樣本，所有患者入院前均已停用左甲狀腺素鈉片(優(yōu)甲樂)4周，歸類為甲癌(TC)組。所有患者根據(jù)病理結(jié)果入院時均診斷為PTC切除術(shù)后。此外，本研究對TC組進(jìn)行再分類，以TPOAb=40IU/mL為橋本甲狀腺炎診斷閾值，高于該閾值認(rèn)定為陽性診斷。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)將TC組的甲狀腺癌患者分為合并橋本甲狀腺炎(TPOAb+)組和不合并橋本甲狀腺炎(TPOAb-)組。另招募15名健康志愿者為HC組。采集患者服用131I之前的糞便樣本以及志愿者的糞便樣本于-80℃保存。所有的患者與志愿者均排除腸道疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，取樣前1個月內(nèi)未服用抗生素、微生物等。研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者和志愿者在知情同意書上簽名。

1.2 實驗室檢查

對64例PTC術(shù)后患者和15名健康對照者進(jìn)行了血清學(xué)檢測及糞便標(biāo)本微生物組學(xué)分析。其中，血清學(xué)檢測包括游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine, FT4)、甲狀腺原氨酸(total triiodothyronine, TT3)、甲狀腺素(total thyroxine, TT4)、促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone, TSH)、TSH受體抗體(thyroid stimulating hormone receptor antibody, TRAb)、甲狀腺球蛋白(human thyroglobulin, HTG)、甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody, TGAb)、甲狀腺微粒體抗體(thyroid microsome antibody, TMAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)、反三碘甲狀腺原氨酸(reverse triiodothyro-nine, r-T3)、2h 甲狀腺攝碘率(t2h)、24h甲狀腺攝碘率(t24h)。

1.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)EZNA?Soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross GA, US)說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA純度和濃度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用正義鏈(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反義鏈(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 DNA測序

使用2%的瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Extraction Kit(Axygen Biosciences)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina Miseq平臺(Illumina Sandiego, USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建雙端(paired-end, PE)測序的文庫并進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用UPARSE軟件(Version 7.1 ，http://drive5.com/uparse)及RDP分類器(http://rdp.cme.msu.edu/)對序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類與細(xì)菌分類的注釋。將TC組和HC組的數(shù)據(jù)分為兩組，根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果及分類信息，在屬水平對群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計分析。利用Majorbio I-Sanger Cloud(www.i-sanger.com)免費在線平臺，與KEGG(Kyoto Encydopedia of Gene and Genomes)數(shù)據(jù)庫，獲得KEGG PATHWAY信息，用環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析對兩組患者的差異細(xì)菌與臨床因素及功能代謝的相關(guān)性等多樣本群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行深入的統(tǒng)計和可視化分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用R語言包(V.3.4.3)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Student’st檢驗進(jìn)行兩組指數(shù)間及物種間差異比較。Mann-Whitney U檢驗用于比較組間臨床因子的差異。應(yīng)用Spearman秩檢驗處理相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本特征及測序信息

TC組和HC組的臨床特征和實驗室檢查結(jié)果見表1。16S rRNA測序的結(jié)果顯示，79個樣本中得到了1941662個序列的信息，通過質(zhì)量控制、過濾及重疊關(guān)系合并處理后，得到24578個讀段，最終鑒別出1072個OTU用于后續(xù)分析。

2.2 PTC患者腸道微生物群失調(diào)

兩組微生物的豐度及多樣性分析結(jié)果如表1所示。TC組中Sobs、Ace、Chao這三種反映微生物豐富度的指數(shù)以及覆蓋指數(shù)顯著低于HC組(P<0.05)。此外，TC組中反映腸道微生物區(qū)系豐富度和均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也低于HC組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果提示，相比于HC組，TC組細(xì)菌豐富度降低。進(jìn)一步分析了PTC術(shù)后患者中的TPOAb+組與TPOAb-組，結(jié)果顯示兩組間的TPOAb水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.045)，而反映兩組腸道微生物群落豐度及多樣性的指數(shù)間的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 甲狀腺癌患者和健康對照的基本特征和臨床指標(biāo)

(續(xù)表1)

圖1 屬水平上腸道微生物群落的相對豐度Fig.1 The relative abundance of the gut microbiota on genus level

圖1直觀展示了TC組與HC組在屬水平上的腸道微生物群落物種組成。屬水平的物種差異分析結(jié)果顯示擬桿菌(Bacteroides)、布勞特氏菌(Blautia)、直腸真桿菌(Eubacteriumrectalegroup)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、Fusicatenibacter菌、霍氏真桿菌(Eubacteriumhalliigroup)的豐度在TC組與HC組間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其中，布勞特菌、直腸真桿菌、雙歧桿菌、Fusicatenibacter菌、霍氏真桿菌在TC組中的豐度低于HC組，而擬桿菌在TC組中的豐度高于HC組，見圖2。同時，這6種菌群表達(dá)在TPOAb+組和TPOAb-組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 差異菌與臨床特征之間的相關(guān)性及差異菌功能注釋分析

TC組6種不同細(xì)菌類群與PTC患者臨床因素的相關(guān)性分析顯示： TC組低豐度的布勞特菌與患者的年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3，P=0.016)；直腸真桿菌與和2h攝碘率和24h攝碘率均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.292，P=0.019)；Fusicatenibacter菌與HTG水平(r=0.355，P=0.004)呈正相關(guān)，而與TGAb水平(r=-0.285，P=0.023)和TPOAb水平(r=-0.266，P=0.034)呈負(fù)相關(guān)，見圖3。

另外，本研究用KEGG數(shù)據(jù)庫的功能注釋分析以及環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析探索了兩組間6種差異菌與功能性代謝之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，擬桿菌與細(xì)胞膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分子呈正相關(guān)(r=0.351，P=0.004)，與異喹啉生物堿生物合成呈負(fù)相關(guān)(r=-0.321，P=0.01)；布勞特菌與異喹啉生物堿生物合成呈正相關(guān)(r=0.251，P=0.045)；直腸真桿菌與細(xì)胞膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分子(r=-0.359，P=0.004)和糖基生物合成(r=-0.438，P<0.001)呈負(fù)相關(guān)；Fusicatenibacter菌與細(xì)胞膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分子呈負(fù)相關(guān)(r=-0.534，P<0.001)。

圖2 屬水平上的TC組和HC組間物種差異圖Fig.2 Difference of species between TC group and HC group on genus level左側(cè)為腸道微生物群落名稱，柱長表示該微生物群落在該組內(nèi)的相對豐度的比例；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3 腸道微生物群落與PTC相關(guān)臨床指標(biāo)相關(guān)性分析熱圖Fig.3 Heatmap of correlative analysis between related indicators in PTC and gut microbiota右側(cè)為腸道微生物群落名稱，下方為臨床因子；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

人體腸道微生物組學(xué)研究需嚴(yán)格把控標(biāo)本采集條件，避免外源性微生物污染。本研究納入的標(biāo)本均來自同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)病房待行131I核素治療的患者。相對于門診，在住院條件下采集患者糞，對于外源性微生物污染的影響因素的可控性較強(qiáng)。值得一提的是，本研究中所有患者具有一致的乳頭狀甲狀腺惡性腫瘤病史，經(jīng)甲狀腺切除術(shù)后停止服用優(yōu)甲樂4周，伴有“甲狀腺功能減退”的臨床表現(xiàn)。本研究只關(guān)注這些特殊情況下的PTC患者。在本研究中，PTC術(shù)后患者的甲狀腺相關(guān)抗體水平高于正常人，反映了PTC術(shù)后患者的甲狀腺免疫功能仍處于失調(diào)狀態(tài)。研究[9]證明，PTC的發(fā)病過程伴隨自身免疫疾病的參與。因此，本研究結(jié)果中的PTC術(shù)后患者的甲狀腺免疫失調(diào)可能源于術(shù)前長期的PTC發(fā)生發(fā)展過程及術(shù)后干預(yù)的綜合影響，而非單一因素的影響。本研究著重于觀察甲狀腺癌術(shù)后“甲減階段”這一特殊群體的腸道微生物結(jié)構(gòu)性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TC組與HC組間的確存在腸道微生物群落結(jié)構(gòu)性差異，這從一定程度上或許可以幫助揭示PTC患者發(fā)病以來的、綜合因素影響下的腸道環(huán)境的變化，從而為進(jìn)一步研究腸道微生物群落變化與甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制間可能存在的相關(guān)性提供可能。

本研究發(fā)現(xiàn)，TC組微生物豐富度顯著低于HC組。這一結(jié)果與最近的Graves病患者[10]和甲狀腺功能亢進(jìn)的動物模型[11]中腸道菌群研究結(jié)果一致。而在橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)患者的腸道微生物群落的研究中，HT患者腸道微生物群落的豐富度和多樣性與健康對照相比稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義[12]。

此外，本研究顯示，在屬的層面上，6種腸道微生物群類在TC組中存在顯著的豐度改變。這些微生物群類在腸道中的改變亦在其他疾病中報道過，包括Fusicatenibacter菌、霍氏真桿菌在潰瘍性結(jié)腸炎患者中豐度的降低[13-14]、布勞特菌在炎性腸病患者中豐度的降低[15]、直腸真桿菌在糖尿病和肺結(jié)核患者中豐度的降低[16-17]。HT作為一種自身免疫疾病，參與PTC的病理過程[9]。而在甲狀腺疾病HT患者的腸道微生物群落的研究中，布勞特菌、直腸真桿菌及霍氏真桿菌的相對豐度較健康對照是升高的，這恰巧與本研究結(jié)果相反。這些相反的結(jié)果可能與HT并存的不同的病理進(jìn)程造成的腸道微生物群落的過度生長有關(guān)[12]。

而本次研究所收集的PTC患者中有20.31%合并HT，因此分析了TPOAb+和TPOAb-組之間的腸道菌群豐富度、多樣性以及腸道微生物群類差異，以觀察HT與腸道微生物群落改變之間是否存在相關(guān)性。結(jié)果顯示，兩組之間的腸道菌群豐富度和多樣性指數(shù)以及腸道菌群的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且TC組與HC組之間的差異菌在TPOAb+和TPOAb-組之間也無差異，這提示了在PTC患者中TPOAb的水平不是影響腸道變化的主要因素，HT可能也只是腫瘤的相關(guān)過程中的繼發(fā)反應(yīng)[18]，本研究中在TC組中出現(xiàn)的腸道微生物群類差異更可能來源于PTC的影響。

從多個關(guān)于腸道微生物群落與其他器官的腫瘤關(guān)系的研究中可知，腸道微生物群落可以通過影響DNA損傷和凋亡、表觀遺傳修飾酶、免疫反應(yīng)等途徑產(chǎn)生致癌作用[19-21]。

TC組存在微生物群類顯著改變是本研究的重要發(fā)現(xiàn)。研究表明，布勞特菌、Fusicatenibacter菌、雙歧桿菌、直腸真桿菌與霍氏真桿菌均具有產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)的能力[13,15,22-23]。SCFAs被普遍認(rèn)為對維持人體健康具有多種重要作用，除保護(hù)腸道黏膜屏障、降低人體炎癥水平等作用[23]，其主要成分包括醋酸、丙酸和丁酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力在體內(nèi)外均得到證實[24-25]。部分差異菌豐度的下降則會導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物SCFAs的減少，削弱SCFAs對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

甲狀腺與腸道在機(jī)體的空間分布距離雖然較遠(yuǎn)，但卻共有豐富的血運及淋巴系統(tǒng)。已證實腸道微生物及其代謝產(chǎn)物能夠通過淋巴液影響機(jī)體生理[26]。已經(jīng)觀察到HT患者的腸通透性增加[27]，從而毒素、抗原或細(xì)菌代謝物可以由腸道進(jìn)入淋巴循環(huán)系統(tǒng)[28]。因此，推測差異菌產(chǎn)生的SCFAs的變化可能通過這種機(jī)制作用于甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

腸道環(huán)境中的微生物亦可能通過調(diào)節(jié)宿主的免疫對癌癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明，輔助T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg)的平衡向Th17傾斜，是PTC的發(fā)病機(jī)制[29]。而雙歧桿菌會刺激T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化[30]，Treg細(xì)胞釋放的IL-10可以改善癌癥患者受損的抗腫瘤免疫功能[29]。在本研究中，雙歧桿菌在TC組中顯著減少，這可能導(dǎo)致Treg細(xì)胞分化的降低和IL-10水平下降。此外，雙歧桿菌能使腫瘤細(xì)胞代謝的關(guān)鍵酶失活，阻斷腫瘤細(xì)胞代謝的能量供應(yīng)，使DNA合成的限速酶核糖核酸酶失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[31]。另外，直腸真桿菌及霍氏真桿菌產(chǎn)生的大量丁酸可以直接抑制免疫細(xì)胞中的一類細(xì)胞核組蛋白脫乙?；负图せ罱M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，影響機(jī)體的免疫功能[23]，且兩者均能抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]。當(dāng)雙歧桿菌、直腸真桿菌及霍氏真桿菌的豐度下降時，其對于癌癥代謝相關(guān)的酶類及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的抑制作用減低，使得機(jī)體對于腫瘤細(xì)胞的監(jiān)控作用減弱，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。雙歧桿菌豐度的降低介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生已經(jīng)在研究中得到驗證[33]。推測雙歧桿菌、直腸真桿菌及霍氏真桿菌的相對豐度的減低對甲狀腺癌的發(fā)生也起到了一定的作用。

在本研究中，患者在甲狀腺全切術(shù)后均按照醫(yī)囑服用優(yōu)甲樂，甲狀腺激素保持在相對正常的水平，在準(zhǔn)備行131I消融治療前停藥4周，伴隨出現(xiàn)激素水平發(fā)生改變的只有T3、T4及TSH。已知甲狀腺激素可以影響消化道，故本研究只關(guān)注了差異菌群與甲狀腺功能臨床指標(biāo)T3、T4及TSH的關(guān)系，結(jié)果顯示差異菌群與甲狀腺激素水平之間無顯著相關(guān)。但是癌癥對機(jī)體的影響不僅僅是甲狀腺功能的改變，因此關(guān)于PTC對腸道微生物群落的影響還需進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

本研究還發(fā)現(xiàn)直腸真桿菌與N-糖基的生物合成相關(guān)，已知N-糖聚糖與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示直腸真桿菌相對豐度的降低可能促進(jìn)PTC的進(jìn)展。但其機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)然，本研究也存在局限性。首先，參加本研究的受試者人數(shù)很少，未來應(yīng)該繼續(xù)增加采樣。其次，雖然糞便樣本易于獲取，但糞便中的腸道微生物無法完全反映腸黏膜上的腸道微生物。此外，是否有定植細(xì)菌存在于甲狀腺及其周圍仍有待探索。本研究發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象的分子機(jī)制需要在體外和體內(nèi)驗證。同時，研究對象均為甲狀腺切除術(shù)后甲減，隨后的研究需增加那些最初被診斷為PTC而沒有接受任何治療的患者。

本研究發(fā)現(xiàn)了PTC患者術(shù)后131I治療前伴隨甲減表現(xiàn)的病程中，腸道微生物結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變，這或許能為PTC相關(guān)的腸道微生物群落的變化提供新的認(rèn)知。