李登赴，郎洪權(quán)，何 軍

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；2. 貴陽市畜牧站，貴州 貴陽 550081；3. 貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081)

【研究意義】肌糖原含量和肌纖維特性是影響豬肉質(zhì)的重要因素。在眾多影響肉質(zhì)的因素中，肌纖維類型被認(rèn)為是調(diào)控肉質(zhì)的關(guān)鍵因素[1-2]，肌纖維占肌肉的75 %～90 %，根據(jù)肌纖維的收縮特性可將其分為不同的類型，由不同類型的肌纖維組成的肌肉存在較大差異[3]。而肌糖原含量是影響肉質(zhì)的本質(zhì)所在[4]，Hamilton等[5]研究表明，豬背最長(zhǎng)肌中的糖酵解潛力(GP)和葡萄糖濃度與肉質(zhì)具有很好的相關(guān)性，可通過糖酵解潛力和葡萄糖濃度來預(yù)測(cè)肉質(zhì)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】本研究室在前期的研究發(fā)現(xiàn)，高坡豬和 “杜×長(zhǎng)×太”三元雜交豬(DLT)的肉質(zhì)存在顯著差異，不同營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)肉質(zhì)的影響不同[6]，但營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)高坡豬和DLT的肌纖維類型及肌糖原含量的影響如何尚未見報(bào)道。因此，研究調(diào)控不同品種和營(yíng)養(yǎng)水平間肉質(zhì)差異的內(nèi)在機(jī)制具有較大生產(chǎn)意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)選用體型相近的高坡豬與DLT為試驗(yàn)對(duì)象，飼喂不同營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制的全價(jià)飼糧，研究不同營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)高坡豬、DLT背最長(zhǎng)肌肌纖維類型和肌糖原含量的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在探討營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)高坡豬和DLT背最長(zhǎng)肌肌纖維類型和肌糖原含量的影響，為深入認(rèn)識(shí)肌纖維類型、糖原含量與肉質(zhì)的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物

試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計(jì)，主效應(yīng)分別為品種(高坡豬、DLT)和營(yíng)養(yǎng)水平[NRC(2012)、中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)]。選擇初始體重為(61.16±4.13) kg的DLT和高坡豬各12頭，分為4個(gè)處理：DLT中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(DLT+C)，DLT NRC飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(DLT+N)，高坡豬中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(高坡豬+C)，高坡豬NRC飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(高坡豬+N)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NRC(2012)及中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)相應(yīng)階段營(yíng)養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)科研試驗(yàn)基地進(jìn)行。單欄飼養(yǎng)，預(yù)試5 d后進(jìn)入正式試驗(yàn)。每日飼喂3次(08:30，13:30，18:30)，少喂勤添，喂料量以料槽內(nèi)略有剩余為度。試驗(yàn)豬自由飲水，圈舍內(nèi)溫度保持在18～20 ℃。

1.4 屠宰及組織取樣

屠宰分批進(jìn)行，當(dāng)試驗(yàn)豬平均體重達(dá)90 kg時(shí)，選擇體重較大的5頭豬進(jìn)行屠宰，分離左側(cè)胴體，迅速在胸腰椎結(jié)合處按肌纖維走向切取2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm背最長(zhǎng)肌肌肉樣2份，投入液氮中保存用以制作冰凍切片，分析肌纖維密度、直徑；另取一部分液氮速凍，用以分析肌纖維類型。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 背最長(zhǎng)肌肌糖原含量 背最長(zhǎng)肌肌糖原含量采用南京建成生物工程研究所肌糖原含量測(cè)定試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5.2 背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑和密度 取解凍后修成1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm的肌肉塊，用冰凍切片機(jī)切成厚2～8 μm的切片，快速HE染色后中性樹膠封片。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) (%)

注：N：NRC(2012)；C：中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)，下同；1．維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供：VA 1200000 IU, VD3300000 IU, VE 750 IU, VK3150 mg, VB160mg, VB2480 mg, VB6180 mg, VB120.9 mg, 泛酸750 mg, 葉酸15 mg, 煙酸105 mg, 抗氧化劑15 mg；2．礦物質(zhì)預(yù)混料可為每千克飼糧提供: 鐵100 mg, 銅5 mg, 鋅80 mg, 錳3 mg, 碘0.14 mg, 硒0.25 mg；3．營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。

Notes: N: National Research Council (2012); C: Chinese Feeding Standard of Swine (2004),The same as below;1.Vitamin premix provides the following per kilogram of diet: VA 1200000 IU, VD3300000 IU, VE 750 IU, VK3150 mg, VB160mg, VB2480 mg, VB6180 mg, VB120.9 mg, pantothenate 750 mg, folic acid 15 mg, niacin 105 mg, antioxidants 15 mg;2.Mineral premix provides the following per kilogram of diet: Fe 100 mg, Cu 5 mg, Zn 80 mg, Mn 3 mg, I 0.14 mg, Se 0.25 mg;3.Calculated values for nutrients.

背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑：將切片置于10×40倍顯微鏡下，用多媒體彩色病理圖像分析儀進(jìn)行測(cè)定。由于肌纖維橫截面積常為不規(guī)則圖形，無法精確測(cè)量其直徑。因此本試驗(yàn)參考橢圓形長(zhǎng)短軸的測(cè)量方法求直徑，每個(gè)樣品測(cè)量45條肌纖維。

表2 目的基因與內(nèi)參基因引物序列

背最長(zhǎng)肌肌纖維密度：將切片置于10×10倍顯微鏡下，用多媒體彩色病理圖像分析儀進(jìn)行測(cè)定。隨機(jī)選15個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)肌纖維數(shù)，求均值后換算成每平方毫米內(nèi)的肌纖維數(shù)。

1.5.3 背最長(zhǎng)肌肌纖維類型 總RNA提?。航M織總RNA的提取采用RNAiso Reagent試劑盒(TaKaRa，中國(guó)，大連)，將保存于超低溫冰箱的背最長(zhǎng)肌樣品按照試劑盒的說明書提取組織總RNA。待RNA干燥后用DEPC水溶解，檢測(cè)所提取RNA的濃度和完整性。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank公布的MyHCI、IIa、IIb、IIx和18S-rRNA的基因序列來設(shè)計(jì)引物并檢測(cè)引物的特異性，以18S-rRNA作為內(nèi)參。引物由Invitrogen公司合成，目的基因和18S-rRNA基因RT-PCR擴(kuò)增引物參數(shù)見表2。

cDNA合成：cDNA的合成采用SYBR Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa，中國(guó)，大連)，嚴(yán)格按說明書操作。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：目的基因和18S-rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線各6個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的cDNA溶液，使用EASY Dilution將cDNA溶液按106、107、108、109、1010和1011濃度梯度稀釋后，各取1 μl進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，中國(guó)，大連)對(duì)內(nèi)參和目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μl：包括5 μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、上下游引物各1 μl (4 μM)、DEPC水2和1 μl cDNA(10 ng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性5 s, 退火25 s(退火溫度見表2)，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度從65～95 ℃，每0.5 ℃讀板1次，每次持續(xù)0.5 s，連續(xù)檢測(cè)熒光。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

MyHCI、IIa、IIb、IIx基因相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算[7]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，采用SAS 9.0軟件的一般線性模型(GLM)程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌糖原含量的影響

由圖1可見，品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌糖原含量有極顯著影響，在同樣營(yíng)養(yǎng)水平下高坡豬豬背最長(zhǎng)肌肌糖原含量均極顯著高于DLT(P<0.01)，高營(yíng)養(yǎng)水平均極顯著降低了DLT和高坡豬的背最長(zhǎng)肌肌糖原含量(P<0.05)。

2.2 品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌纖維直徑和密度的影響

由圖2可知，品種對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑和密度均有較大影響，高坡豬的背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑極顯著小于DLT(P<0.01)，而密度極顯著大于DLT(P<0.01)，營(yíng)養(yǎng)水平提高了豬背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑和降低了密度，但差異不顯著。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below圖1 品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌糖原含量的影響Fig.1 Effects of breed and nutrient level on muscle glycogen of LM of pigs

圖2 營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑(A)和密度(B)的影響Fig.2 Effects of breed and nutrient level on fiber diameter (A)and density (B)of LM of pigs

2.3 品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌纖維類型的影響

由圖3可知，品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌MyHCIIb有較大影響，高坡豬的背最長(zhǎng)肌MyHCIIb均低于DLT，在中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下高坡豬極顯著低于DLT(P<0.01)，在NRC飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下不顯著(P>0.05)；營(yíng)養(yǎng)水平均極顯著提高了DLT和高坡豬的背最長(zhǎng)肌MyHCIIb的相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)MyHCIIx比例有顯著的互作效應(yīng)，營(yíng)養(yǎng)水平升高顯著提高了DLT豬背最長(zhǎng)肌MyHCIIx型纖維比例(P<0.05)，而對(duì)高坡豬的背最長(zhǎng)肌MyHCIIx型纖維比例無顯著影響(P>0.05)。此外，品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌 MyHCI和IIa型纖維比例無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

肌糖原含量是影響最終pH的一個(gè)重要因素[8]，豬AMPK的γ亞基PRKAG3的點(diǎn)突變，導(dǎo)致了豬肌肉中葡萄糖代謝包括糖原儲(chǔ)備的紊亂，進(jìn)而引起酸肉的發(fā)生[8]。但關(guān)于高坡豬和DLT背最長(zhǎng)肌肌糖原含量與最終pH的相關(guān)性尚不明確。李夢(mèng)云等[9]在100 kg階段，漢普夏豬骨骼肌中肌糖原含量顯著高于長(zhǎng)撒豬，pH24 h顯著低于長(zhǎng)撒豬，而pH45min則差異不顯著。Henckel等[10]研究結(jié)果也表明，肌糖原含量與最終pH呈負(fù)相關(guān)性。研究表明，飼喂相同營(yíng)養(yǎng)水平的飼糧，高坡豬宰后45 min到24 h之間背最長(zhǎng)肌pH的降低較DLT緩慢[6]。在本試驗(yàn)中，高坡豬背最長(zhǎng)肌肌糖原含量高于DLT，表明高坡豬較高的肌糖原含量在一定程度上延緩了pH的降低。而高營(yíng)養(yǎng)水平飼糧降低了高坡豬和DLT的背最長(zhǎng)肌肌糖原含量，這與潘洪彬等[11]高能量和高蛋白質(zhì)日糧均可加快烏金豬肝糖原和肌糖原合成的結(jié)論相反。造成此差異的主要原因可能是飼養(yǎng)條件和品種的差異。

圖3 品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌MyHCI(A)、MyHCIIa(B)、MyHCIIx(C)和MyHCIIb(D)相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of breed and nutrient level on MyHCI (A)，MyHCIIa (B)，MyHCIIx (C) and MyHCIIb (D) relative expression in LM of pigs

肌纖維的直徑和密度是影響肉質(zhì)的重要指標(biāo)，肌纖維直徑越小而密度越大的品種其肌內(nèi)脂肪沉積越多[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高坡豬和DLT的背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑和密度存在一定差異：高坡豬的背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑小于DLT，而密度大于DLT。這可能是高坡豬雖然生長(zhǎng)速度緩慢，但肉質(zhì)較好的原因。李登赴等[6]對(duì)比了高坡豬和DLT的肉質(zhì)，結(jié)果也表明高坡豬肉質(zhì)優(yōu)于DLT。在本試驗(yàn)中，營(yíng)養(yǎng)水平升高僅顯著增加了DLT的背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑，而對(duì)高坡豬和DLT肌纖維密度無顯著影響。由此推測(cè)，影響肌纖維直徑和密度的主要因素是品種。但營(yíng)養(yǎng)與品種間互作效應(yīng)對(duì)肌纖維的影響還有待進(jìn)一步研究。近年來雖然通過環(huán)境條件控制、營(yíng)養(yǎng)改進(jìn)及遺傳育種等手段調(diào)控豬產(chǎn)肉性能有了明顯改善且瘦肉率及生長(zhǎng)發(fā)育速度也得以提高，但也同時(shí)降低了豬的肉質(zhì)，在以后的豬研究中，重點(diǎn)在于如何尋找?guī)渍咧g的平衡點(diǎn)。

品種對(duì)肌纖維類型百分組成的影響，具有中等以上的遺傳力(h2=0.2～0.59 )，其中I和IIb型肌纖維比例具有高遺傳力，分別為0.46和0.58[13]。本實(shí)驗(yàn)中兩品種背最長(zhǎng)肌MyHCIIb型纖維表達(dá)差異極顯著，表現(xiàn)為高坡豬IIb型肌纖維極顯著低于DLT。高坡豬和DLT的差異是長(zhǎng)期不同生長(zhǎng)環(huán)境影響的結(jié)果，豬出生后肌纖維數(shù)目不再發(fā)生變化肌肉生長(zhǎng)速度主要由肌纖維體積決定。此結(jié)果與以往國(guó)內(nèi)很多結(jié)論一致，楊曉靜等[14]通過比較二花臉豬和大白豬背最長(zhǎng)肌肌纖維組成差異發(fā)現(xiàn)，大白豬90 d后IIb型肌纖維顯著高于二花臉豬，IIb型肌纖維比例的顯著增加可能與其肌肉快速沉積有關(guān)；楊飛云等[15]研究了地方品種榮昌豬與杜×長(zhǎng)×大豬背最長(zhǎng)肌肌纖維組成差異發(fā)現(xiàn)，杜×長(zhǎng)×大豬背最長(zhǎng)肌含有更多的IIb型肌纖維。同時(shí)中國(guó)地方品種對(duì)比對(duì)國(guó)外品種也得到類似結(jié)果，如金華豬[16]、二花臉豬[15]、梅山豬[17]和萊蕪豬[18]等中國(guó)地方品種和國(guó)外瘦肉型品種的肌纖維類型，發(fā)現(xiàn)中國(guó)地方品種的背最長(zhǎng)肌中氧化型纖維含量較高。

由于豬的肌纖維增殖在出生前就已完成，故出生后的營(yíng)養(yǎng)狀況不會(huì)影響肌纖維數(shù)，主要影響肌纖維的肥大與類型轉(zhuǎn)化。營(yíng)養(yǎng)不良可顯著降低肌纖維大小，且對(duì)快速酵解II型肌纖維的影響程度較其他類型的大[19-20]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，營(yíng)養(yǎng)水平升高顯著提高了高坡豬背最長(zhǎng)肌MyHCIIb型纖維表達(dá)量，而MyHCI、IIa和IIx無顯著變化。楊飛云等[21]認(rèn)為出生后營(yíng)養(yǎng)還可調(diào)控MyHC異構(gòu)體的表達(dá)，進(jìn)而影響肌纖維類型的轉(zhuǎn)化和肌肉表達(dá)。但是營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的作用機(jī)制還未見相關(guān)報(bào)道，尤其是營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)生長(zhǎng)豬肌纖維類型的影響機(jī)制。

肌纖維類型是決定肉品質(zhì)的一個(gè)重要因素[22-24]，它與肉品的pH、風(fēng)味和顏色密切相關(guān)。表達(dá)不同MyHC異構(gòu)體的肌纖維具有不同的代謝特性，MyHC I, IIa, IIx和IIb型肌纖維的有氧代謝強(qiáng)度依次遞減[25]。經(jīng)過長(zhǎng)期的集約化選育，現(xiàn)代快速生長(zhǎng)的豬種在顯著提高瘦肉率產(chǎn)量的同時(shí)也提高酵解型肌纖維的比例，降低氧化型肌纖維的比例，使肌肉代謝發(fā)生變化，從而導(dǎo)致肉品質(zhì)下降[15]。因此，品種是決定肉質(zhì)的主要因素之一，不同品種的豬之所以肉品質(zhì)不同，歸根結(jié)底是由于肌纖維類型不同，這也是中國(guó)地方品種豬肉質(zhì)優(yōu)良的原因。

4 結(jié) 論

綜上所述，品種和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬肌糖原含量、肌纖維組織學(xué)特性和類型均有不同影響，高坡豬和DLT的背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑、密度和肌纖維類型差異較大，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)兩品種背最長(zhǎng)肌肌糖原含量和MyHCIIb型肌纖維影響也較大。在本試驗(yàn)中，高坡豬的背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑和MyHCIIb型肌纖維均極顯著低于DLT，密度也極顯著大于DLT，這可能與李登赴等[6]高坡豬優(yōu)良的肉質(zhì)相關(guān)。今后肌纖維類型的轉(zhuǎn)化及其調(diào)控因素，肌纖維類型與肉品質(zhì)之間的關(guān)系等還需要更加深入的研究。