葉春秀，王志軍，趙曾強，莊振剛，馬盼盼，楊永林

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院/作物種植創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；3.石河子農(nóng)業(yè)科技開發(fā)研究中心棉花研究所，新疆 石河子 832000)

【研究意義】TILLING 技術(shù)作為反向遺傳學(xué)技術(shù)之一，已在部分主要作物種質(zhì)創(chuàng)新過程中得到了廣泛的應(yīng)用，已成功地應(yīng)用于小麥[1-3]、玉米[4-5]、花生[6-7]、水稻[8-9]、向日葵[10]、大豆[11-12]、高粱和油菜[13-16]等作物的育種及功能基因組學(xué)研究中，取得了不少研究成果，并且建立了相關(guān)的 TILLING育種技術(shù)平臺?？焖勹b定突變種質(zhì)是TILLING技術(shù)應(yīng)用過程中的一個重要步驟，傳統(tǒng)的鑒定方法較為繁瑣且費用昂貴?！厩叭搜芯窟M展】Eco-TIllING技術(shù)是通過 TILLING 技術(shù)去找尋自然群體中等位基因變異的技術(shù)，在生物基因多態(tài)性的檢測上較為直觀與直接，在擬南芥[17]、大麥[18]、小麥[19]等多種植物中得到廣泛應(yīng)用[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c】棉花作為主要的經(jīng)濟作物之一，TILLING 技術(shù)的應(yīng)用與其它作物育種相比有所欠缺[22-23]，將后基因組時代的相關(guān)技術(shù)應(yīng)用到棉花育種過程中將是一個必然的發(fā)展趨勢和方向，TILLING 技術(shù)在棉花育種中是否存在著相同的應(yīng)用價值及應(yīng)用過程中存在的關(guān)鍵性問題，值得深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文擬在通過對前期采用TILLING技術(shù)創(chuàng)制的棉花種質(zhì)資源進行表型性狀和分子生物學(xué)水平的鑒定，驗證TILLING技術(shù)在棉花種質(zhì)創(chuàng)新方面應(yīng)用的可行性，并探索應(yīng)用過程中的關(guān)鍵步驟，為深入有效、穩(wěn)定利用該技術(shù)創(chuàng)制棉花種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用材料為前期采用化學(xué)誘變劑處理獲得的后代材料，目前已經(jīng)成為基本穩(wěn)定的材料，共計4份材料，包括1份對照材料(用石引對照表示)，3份不同劑量誘變劑處理后的后代材料(分別用石引150、石引200、石引250表示)。

1.2 CELI酶的提取

CELI酶的提取采用蛋白質(zhì)提取試劑盒進行，具體方法參照相應(yīng)的說明書，如下：①在1 mL蛋白提取裂解液中加入適量蛋白酶抑制劑和PMSF(苯甲基磺酰氟)；②取100 mg新鮮芹菜嫩葉或莖稈組織放入研缽中，并在液氮環(huán)境中碾碎；③將碾碎后的芹菜嫩葉或莖稈組織，加入步驟1混合而成的裂解液中，在4 ℃溫度條件下裂解20～30 min；④在4 ℃溫度條件下，10 000 r/min，離心30 min，吸取上清液，即得CELI酶粗提液，提取物分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3 CELI酶的活性檢測

以標準酶SURVEYOR Mutation Detection Kit Components為對照，用提取的CELI酶對擴增的Control C和Control G異質(zhì)雙鏈DNA分子進行酶切，比較提取的CELI酶粗提液與SURVEYOR酶的酶切效果，具體驗證步驟：①對SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中的Control C和Control G(with primers)在最佳退火溫度下進行PCR擴增，20 μl PCR體系包括10×Taqbuffer 2 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，Control C/Control G(with primers)2 μl，E×Taq(5 U/μl)0.2 μl，DNA模板2 μl，ddH2O 12.8 μl。PCR擴增程序為95 ℃ 2 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，32個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。②取4 μl PCR擴增產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保擴增產(chǎn)物單一且濃度適宜后進行異質(zhì)雙鏈的合成，分別取Control C和Control G(with primers)的PCR擴增產(chǎn)物各10 μl，經(jīng)過表1所示的PCR擴增程序，獲得堿基錯配的異質(zhì)雙鏈DNA分子。③以SURVEYOR酶為對照，用本實施例提取的CELI酶粗提液對異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物進行酶切，酶切溫度45 ℃，酶切時間40 min，酶切體系為10 μl異質(zhì)雙鏈DNA分子 + 8 μl ddH2O + 2 μl SURVEYOR/CELI酶粗提液。④酶切結(jié)束后，加入2 μl的6×loading Buffer在2 %的瓊脂糖凝膠電泳上進行酶切效果檢測，比較分析本實施例提取的CELI酶粗提液與SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中SURVEYOR酶的酶切效果。

表1 堿基錯配異質(zhì)雙鏈形成PCR擴增程序

1.4 基因組DNA的制備

從每份材料中隨機選取10份單株進行基因組DNA的提取，采用CTAB法進行提取，用核酸檢測儀進行DNA質(zhì)量和濃度的檢測。

1.5 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因序列查找及引物設(shè)計

根據(jù)連續(xù)3年(2015-2017)的纖維測量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)4份材料在纖維長度上存在較明顯的差異，參照棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因文獻選取了6個與纖維發(fā)育相關(guān)的基因序列進行引物設(shè)計，用于實驗驗證，具體序列如表2。

1.6 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因Eco-Tilling分析

將提取的對照和突變體材料基因組DNA進行稀釋，使?jié)舛缺３忠恢拢缓筮M行基因PCR擴增，擴增體系為20 μl，包括10×PCR Buffer 2 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，引物各1 μl，E×Taq(5 U/μl)0.2 μl，DNA模板2 μl，ddH2O 12.8 μl。PCR擴增程序為95 ℃ 2 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s(根據(jù)各引物退火溫度進行設(shè)置)，72 ℃ 50 s，32個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存 。

表2 纖維發(fā)育相關(guān)基因引物序列

PCR程序結(jié)束后，取5 μl產(chǎn)物進行瓊脂糖(濃度為2 %)電泳檢測，確定在對照和誘變材料上所得到的產(chǎn)物都為單一、特異性條帶；然后分別取對照和誘變材料PCR產(chǎn)物，按照等體積(各10 μl)進行混合，在PCR儀上進行PCR產(chǎn)物的雜交，形成錯配異質(zhì)鏈，雜交程序為99 ℃ 2 min，99 ℃降至72 ℃ (-1 ℃/s)，72 ℃降至25 ℃(-0.3 ℃/s)，4 ℃保存。

將異質(zhì)鏈采用提取的CELI酶進行酶切，酶切體系為：2 μl錯配異質(zhì)鏈，2 μlCELI酶，8 μl ddH2O。酶切程序為45 ℃保持30～60 min，酶切產(chǎn)物采用4 %的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.7 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因測序驗證

將經(jīng)過酶切后能夠產(chǎn)生酶切條帶的基因PCR產(chǎn)物進行載體連接、轉(zhuǎn)化、涂板和初步驗證后，連接正確菌液送測序公司測序，對照和誘變材料相應(yīng)基因各送5個重復(fù)菌液。

1.8 測序數(shù)據(jù)分析

對從測序公司獲得的序列數(shù)據(jù)采用軟件DNAMAN進行比對，確定誘變材料與對照相應(yīng)基因序列之間的差異堿基類型及位置，與前期酶切結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜CELI酶的提取及其活性驗證

由圖1可以看出，采用蛋白質(zhì)提取試劑盒能夠從芹菜的不同組織中獲得與預(yù)期大小一致的CELI條帶，并且從嫩葉中提取的酶較莖中提取的效果好，為后期的實驗開展提供了借鑒。通過與購買的試劑盒內(nèi)標準的CELI酶類進行酶切效果及活性實驗對比，發(fā)現(xiàn)從芹菜中提取的CELI酶同樣能夠達到預(yù)期的酶切效果(圖2)，說明提取的CELI能夠替代試劑盒中的類似酶，用于后期的試驗降低了實驗成本。

圖1 CELI酶提取的SDS-PAGE考馬斯亮藍染色圖Fig.1 SDS-PAGE ofCELI enzyme

2.2 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因Eco-Tilling分析結(jié)果

從酶切電泳圖和測序結(jié)果分析得到，在選取設(shè)計的6個與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因中，其中4對引物能夠擴增得到單一、特異性的條帶(圖3A)，4對引物中最終只有2對引物擴增基因在材料間存在著SNP差異(圖3B)，分析測序結(jié)果證明引物L-D-1F/1R擴增基因在材料間存在著SNP差異，比對結(jié)果顯示該基因為纖維相關(guān)基因Gh14-3-3L，其中擴增產(chǎn)物在石引150與對照材料存在1個SNP位點差異，位于320 bp處(插入1個堿基T)，測序驗證得到2條條帶(分別為320和453 bp)；石引200與對照材料存在2個SNP位點，分別位于320和380 bp處(320 bp處插入1個堿基T，380 bp處堿基T變?yōu)镚)，測序驗證得到3條條帶(分別為320、60和393 bp)；石引250與對照存在1個SNP位點，位于320 bp處(插入1個堿基T)，測序驗證得到2條條帶(分別為320和453 bp，圖4)。

圖2 CELI與試劑盒Surveyor酶活性對比檢測圖Fig.2 The compairson chart ofCELI activity and surveyor kit

A.對照與誘變材料差異基因擴增圖示；B.對照與誘變材料CELI酶酶切圖示A. The figure of amplification; B. The figure of enzymatic圖3 對照與誘變材料差異基因擴增及CELI酶酶切圖示Fig.3 The figure of differential gene amplification andCELI enzymatic between control and mutant materials

L-1：對照材料；L-2：石引150材料；L-3：石引200材料；L-4：石引250材料L-1: Control;L-2:Shiyin150;L-3:Shiyin200;L-4:Shiyin 250圖4 誘變材料與對照材料Gh14-3-3L基因核苷酸序列差異Fig.4 The nucleotide sequence compairson ofGh14-3-3Lbetween control and mutant materials

2.3 棉花纖維相關(guān)基因Gh14-3-3突變SNP位點結(jié)構(gòu)分析

對Gh14-3-3進行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，誘變獲得的3份材料均在320 bp處存在1個SNP位點的改變，編碼的氨基酸由半胱氨酸(C)變?yōu)榱涟彼?L)，使該基因的開放閱讀框發(fā)生了改變(提前終止)，由編碼132個氨基酸變?yōu)?04個氨基酸，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變(圖5)。 對比對照和誘變材料Gh14-3-3L基因氨基酸與保守序列發(fā)現(xiàn)，開放閱讀框內(nèi)有1個氨基酸發(fā)生，使開放閱讀框提前終止，從而改變了基因的保守序列的長短(圖6)誘變材料的保守序列相對于對照材料縮短，使蛋白結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。

2.4 棉花纖維相關(guān)基因Gh14-3-3保守區(qū)域及結(jié)構(gòu)分析

由三級結(jié)構(gòu)分析可以看出，突變前后的蛋白均屬于Gh14-3-3蛋白家族，突變前的蛋白結(jié)構(gòu)屬于該家族典型的結(jié)構(gòu)，具有9個α-螺旋，而突變后的蛋白結(jié)構(gòu)由于編碼框長度的改變，最終變?yōu)?個α-螺旋。對照與誘變材料Gh14-3-3蛋白在親水與疏水性方面的差異不明顯，屬于疏水性蛋白(圖8)。

L-1：對照材料；L-2：石引150材料；L-3：石引200材料；L-4：石引250材料L-1: Control;L-2:Shiyin150;L-3:Shiyin200;L-4:Shiyin 250圖5 誘變與對照材料Gh14-3-3L基因氨基酸序列差異Fig.5 The amino acid sequence compairson of Gh14-3-3L between control and mutant materials

A.誘變材料Gh14-3-3基因保守區(qū)域； B. 對照材料Gh14-3-3基因保守區(qū)域A.Mutant materials; B. Control圖6 誘變與對照材料Gh14-3-3L基因保守區(qū)域分析差異Fig.6 TheGhI4-3-3Lgene conservative region comparison of mutagenic and control material

A.對照材料Gh14-3-3基因蛋白；B～C. 誘變材料Gh14-3-3基因蛋白A.Control； B-C.Mutant material圖7 對照材料和誘變材料Gh14-3-3L蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 The tertiary structure comparison of Gh14-3-3L protein between control and mutagenic material

2.5 對照與誘變材料纖維數(shù)據(jù)比較

連續(xù)3年(2015-2017)測定對照與誘變材料的纖維長度數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)石引200絨長數(shù)據(jù)分析與對照存在差異性，石引150和石引250絨長數(shù)據(jù)與對照沒差異性，數(shù)據(jù)結(jié)果與SNP位點和測序數(shù)據(jù)存在一致性，推斷可能與石引200材料SNP位點數(shù)較其它兩個材料多1個有關(guān)，具體關(guān)聯(lián)性待進一步驗證。

3 討 論

傳統(tǒng)的育種手段與現(xiàn)代生物育種技術(shù)相比仍比較原始和落后，使育種水平的提高受到很大限制，同時，由于受到棉花品種內(nèi)在和外在條件的限制，育種周期較長，制約了培育新品種的速度。因此，如何加快棉花的育種速度，是多少年來育種家一直渴望解決的問題，也是當前擺脫育種困境的關(guān)鍵，擬南芥TILLING[17]計劃的成功實施，帶動了多種作物TILLING 檢測服務(wù)系統(tǒng)，這些專項 TILLING 計劃，通過建立標準化的 TILLING技術(shù)平臺，共享突變體網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源，提高了突變檢測效率，降低成本，可以有效地服務(wù)于科研及企事業(yè)單位，提高TILLING 技術(shù)應(yīng)用效率。隨著越來越多物種基因組序列的破譯，將會進一步擴大 TILLING 技術(shù)的物種檢測范圍及其更多的目標基因，這為TILLING 技術(shù)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[5-6,8,17]。本文通過探索TILLING 技術(shù)在新疆早熟陸地棉種質(zhì)創(chuàng)新過程中的關(guān)鍵問題，構(gòu)建可靠的TILLING 技術(shù)體系，同時借助于這種技術(shù)篩選出一些在抗逆與品質(zhì)性狀方面具有利用價值的新種質(zhì)，為相應(yīng)的栽培品種選育及研究提供新的種質(zhì)，拓展新疆棉花種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。

A.Gh14-3-3蛋白親水性圖示；B.Gh14-3-3蛋白疏水性圖示A. The hydrophilicity of Gh14-3-3L;B. The Hydrophobicity of Gh14-3-3L圖8 對照材料和誘變材料Gh14-3-3L蛋白親疏水性Fig.8 The hydrophilicity and hydrophobicity comparison of Gh14-3-3L gene protein between control and mutant material

圖9 對照材料和誘變材料纖維數(shù)據(jù)差異顯著性分析Fig.9 The significant difference analysis of fiber data between control and mutagenic material

4 結(jié) 論

通過對前期獲得誘變材料進行表型性狀與分子水平的驗證，發(fā)現(xiàn)采用獲得的誘變體系和鑒定技術(shù)創(chuàng)制棉花種質(zhì)具有可行性，所得材料在表型性狀及分子水平方面都發(fā)生了變異，并且變異位點與表型性狀的變異具有關(guān)聯(lián)性，研究結(jié)果能夠為深入研究TILLING技術(shù)在棉花及其它植物種質(zhì)資源創(chuàng)制方面提供理論依據(jù)和技術(shù)。