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        棉花誘變種質(zhì)Gh14-3-3L基因的Eco-TILLING分析

        2019-05-15 01:09:04葉春秀王志軍趙曾強(qiáng)莊振剛馬盼盼楊永林
        關(guān)鍵詞:異質(zhì)種質(zhì)棉花

        葉春秀,王志軍,趙曾強(qiáng),莊振剛,馬盼盼,楊永林

        (1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院/作物種植創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆 烏魯木齊 830000;3.石河子農(nóng)業(yè)科技開發(fā)研究中心棉花研究所,新疆 石河子 832000)

        【研究意義】TILLING 技術(shù)作為反向遺傳學(xué)技術(shù)之一,已在部分主要作物種質(zhì)創(chuàng)新過程中得到了廣泛的應(yīng)用,已成功地應(yīng)用于小麥[1-3]、玉米[4-5]、花生[6-7]、水稻[8-9]、向日葵[10]、大豆[11-12]、高粱和油菜[13-16]等作物的育種及功能基因組學(xué)研究中,取得了不少研究成果,并且建立了相關(guān)的 TILLING育種技術(shù)平臺??焖勹b定突變種質(zhì)是TILLING技術(shù)應(yīng)用過程中的一個(gè)重要步驟,傳統(tǒng)的鑒定方法較為繁瑣且費(fèi)用昂貴?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】Eco-TIllING技術(shù)是通過 TILLING 技術(shù)去找尋自然群體中等位基因變異的技術(shù),在生物基因多態(tài)性的檢測上較為直觀與直接,在擬南芥[17]、大麥[18]、小麥[19]等多種植物中得到廣泛應(yīng)用[20-21]。【本研究切入點(diǎn)】棉花作為主要的經(jīng)濟(jì)作物之一,TILLING 技術(shù)的應(yīng)用與其它作物育種相比有所欠缺[22-23],將后基因組時(shí)代的相關(guān)技術(shù)應(yīng)用到棉花育種過程中將是一個(gè)必然的發(fā)展趨勢和方向,TILLING 技術(shù)在棉花育種中是否存在著相同的應(yīng)用價(jià)值及應(yīng)用過程中存在的關(guān)鍵性問題,值得深入研究?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本文擬在通過對前期采用TILLING技術(shù)創(chuàng)制的棉花種質(zhì)資源進(jìn)行表型性狀和分子生物學(xué)水平的鑒定,驗(yàn)證TILLING技術(shù)在棉花種質(zhì)創(chuàng)新方面應(yīng)用的可行性,并探索應(yīng)用過程中的關(guān)鍵步驟,為深入有效、穩(wěn)定利用該技術(shù)創(chuàng)制棉花種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        本實(shí)驗(yàn)所用材料為前期采用化學(xué)誘變劑處理獲得的后代材料,目前已經(jīng)成為基本穩(wěn)定的材料,共計(jì)4份材料,包括1份對照材料(用石引對照表示),3份不同劑量誘變劑處理后的后代材料(分別用石引150、石引200、石引250表示)。

        1.2 CELI酶的提取

        CELI酶的提取采用蛋白質(zhì)提取試劑盒進(jìn)行,具體方法參照相應(yīng)的說明書,如下:①在1 mL蛋白提取裂解液中加入適量蛋白酶抑制劑和PMSF(苯甲基磺酰氟);②取100 mg新鮮芹菜嫩葉或莖稈組織放入研缽中,并在液氮環(huán)境中碾碎;③將碾碎后的芹菜嫩葉或莖稈組織,加入步驟1混合而成的裂解液中,在4 ℃溫度條件下裂解20~30 min;④在4 ℃溫度條件下,10 000 r/min,離心30 min,吸取上清液,即得CELI酶粗提液,提取物分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

        1.3 CELI酶的活性檢測

        以標(biāo)準(zhǔn)酶SURVEYOR Mutation Detection Kit Components為對照,用提取的CELI酶對擴(kuò)增的Control C和Control G異質(zhì)雙鏈DNA分子進(jìn)行酶切,比較提取的CELI酶粗提液與SURVEYOR酶的酶切效果,具體驗(yàn)證步驟:①對SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中的Control C和Control G(with primers)在最佳退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,20 μl PCR體系包括10×Taqbuffer 2 μl,2.5 mM dNTPs 2 μl,Control C/Control G(with primers)2 μl,E×Taq(5 U/μl)0.2 μl,DNA模板2 μl,ddH2O 12.8 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 2 min;94 ℃ 50 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min;4 ℃保存。②取4 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,確保擴(kuò)增產(chǎn)物單一且濃度適宜后進(jìn)行異質(zhì)雙鏈的合成,分別取Control C和Control G(with primers)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μl,經(jīng)過表1所示的PCR擴(kuò)增程序,獲得堿基錯(cuò)配的異質(zhì)雙鏈DNA分子。③以SURVEYOR酶為對照,用本實(shí)施例提取的CELI酶粗提液對異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行酶切,酶切溫度45 ℃,酶切時(shí)間40 min,酶切體系為10 μl異質(zhì)雙鏈DNA分子 + 8 μl ddH2O + 2 μl SURVEYOR/CELI酶粗提液。④酶切結(jié)束后,加入2 μl的6×loading Buffer在2 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行酶切效果檢測,比較分析本實(shí)施例提取的CELI酶粗提液與SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中SURVEYOR酶的酶切效果。

        表1 堿基錯(cuò)配異質(zhì)雙鏈形成PCR擴(kuò)增程序

        1.4 基因組DNA的制備

        從每份材料中隨機(jī)選取10份單株進(jìn)行基因組DNA的提取,采用CTAB法進(jìn)行提取,用核酸檢測儀進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度的檢測。

        1.5 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因序列查找及引物設(shè)計(jì)

        根據(jù)連續(xù)3年(2015-2017)的纖維測量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)4份材料在纖維長度上存在較明顯的差異,參照棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因文獻(xiàn)選取了6個(gè)與纖維發(fā)育相關(guān)的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,具體序列如表2。

        1.6 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因Eco-Tilling分析

        將提取的對照和突變體材料基因組DNA進(jìn)行稀釋,使?jié)舛缺3忠恢拢缓筮M(jìn)行基因PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為20 μl,包括10×PCR Buffer 2 μl,2.5 mM dNTPs 2 μl,引物各1 μl,E×Taq(5 U/μl)0.2 μl,DNA模板2 μl,ddH2O 12.8 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 2 min;94 ℃ 50 s,55 ℃ 45 s(根據(jù)各引物退火溫度進(jìn)行設(shè)置),72 ℃ 50 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min;4 ℃保存 。

        表2 纖維發(fā)育相關(guān)基因引物序列

        PCR程序結(jié)束后,取5 μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(濃度為2 %)電泳檢測,確定在對照和誘變材料上所得到的產(chǎn)物都為單一、特異性條帶;然后分別取對照和誘變材料PCR產(chǎn)物,按照等體積(各10 μl)進(jìn)行混合,在PCR儀上進(jìn)行PCR產(chǎn)物的雜交,形成錯(cuò)配異質(zhì)鏈,雜交程序?yàn)?9 ℃ 2 min,99 ℃降至72 ℃ (-1 ℃/s),72 ℃降至25 ℃(-0.3 ℃/s),4 ℃保存。

        將異質(zhì)鏈采用提取的CELI酶進(jìn)行酶切,酶切體系為:2 μl錯(cuò)配異質(zhì)鏈,2 μlCELI酶,8 μl ddH2O。酶切程序?yàn)?5 ℃保持30~60 min,酶切產(chǎn)物采用4 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

        1.7 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因測序驗(yàn)證

        將經(jīng)過酶切后能夠產(chǎn)生酶切條帶的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行載體連接、轉(zhuǎn)化、涂板和初步驗(yàn)證后,連接正確菌液送測序公司測序,對照和誘變材料相應(yīng)基因各送5個(gè)重復(fù)菌液。

        1.8 測序數(shù)據(jù)分析

        對從測序公司獲得的序列數(shù)據(jù)采用軟件DNAMAN進(jìn)行比對,確定誘變材料與對照相應(yīng)基因序列之間的差異堿基類型及位置,與前期酶切結(jié)果進(jìn)行比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 芹菜CELI酶的提取及其活性驗(yàn)證

        由圖1可以看出,采用蛋白質(zhì)提取試劑盒能夠從芹菜的不同組織中獲得與預(yù)期大小一致的CELI條帶,并且從嫩葉中提取的酶較莖中提取的效果好,為后期的實(shí)驗(yàn)開展提供了借鑒。通過與購買的試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的CELI酶類進(jìn)行酶切效果及活性實(shí)驗(yàn)對比,發(fā)現(xiàn)從芹菜中提取的CELI酶同樣能夠達(dá)到預(yù)期的酶切效果(圖2),說明提取的CELI能夠替代試劑盒中的類似酶,用于后期的試驗(yàn)降低了實(shí)驗(yàn)成本。

        圖1 CELI酶提取的SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色圖Fig.1 SDS-PAGE ofCELI enzyme

        2.2 棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因Eco-Tilling分析結(jié)果

        從酶切電泳圖和測序結(jié)果分析得到,在選取設(shè)計(jì)的6個(gè)與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因中,其中4對引物能夠擴(kuò)增得到單一、特異性的條帶(圖3A),4對引物中最終只有2對引物擴(kuò)增基因在材料間存在著SNP差異(圖3B),分析測序結(jié)果證明引物L(fēng)-D-1F/1R擴(kuò)增基因在材料間存在著SNP差異,比對結(jié)果顯示該基因?yàn)槔w維相關(guān)基因Gh14-3-3L,其中擴(kuò)增產(chǎn)物在石引150與對照材料存在1個(gè)SNP位點(diǎn)差異,位于320 bp處(插入1個(gè)堿基T),測序驗(yàn)證得到2條條帶(分別為320和453 bp);石引200與對照材料存在2個(gè)SNP位點(diǎn),分別位于320和380 bp處(320 bp處插入1個(gè)堿基T,380 bp處堿基T變?yōu)镚),測序驗(yàn)證得到3條條帶(分別為320、60和393 bp);石引250與對照存在1個(gè)SNP位點(diǎn),位于320 bp處(插入1個(gè)堿基T),測序驗(yàn)證得到2條條帶(分別為320和453 bp,圖4)。

        圖2 CELI與試劑盒Surveyor酶活性對比檢測圖Fig.2 The compairson chart ofCELI activity and surveyor kit

        A.對照與誘變材料差異基因擴(kuò)增圖示;B.對照與誘變材料CELI酶酶切圖示A. The figure of amplification; B. The figure of enzymatic圖3 對照與誘變材料差異基因擴(kuò)增及CELI酶酶切圖示Fig.3 The figure of differential gene amplification andCELI enzymatic between control and mutant materials

        L-1:對照材料;L-2:石引150材料;L-3:石引200材料;L-4:石引250材料L-1: Control;L-2:Shiyin150;L-3:Shiyin200;L-4:Shiyin 250圖4 誘變材料與對照材料Gh14-3-3L基因核苷酸序列差異Fig.4 The nucleotide sequence compairson ofGh14-3-3Lbetween control and mutant materials

        2.3 棉花纖維相關(guān)基因Gh14-3-3突變SNP位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析

        對Gh14-3-3進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),誘變獲得的3份材料均在320 bp處存在1個(gè)SNP位點(diǎn)的改變,編碼的氨基酸由半胱氨酸(C)變?yōu)榱涟彼?L),使該基因的開放閱讀框發(fā)生了改變(提前終止),由編碼132個(gè)氨基酸變?yōu)?04個(gè)氨基酸,從而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變(圖5)。 對比對照和誘變材料Gh14-3-3L基因氨基酸與保守序列發(fā)現(xiàn),開放閱讀框內(nèi)有1個(gè)氨基酸發(fā)生,使開放閱讀框提前終止,從而改變了基因的保守序列的長短(圖6)誘變材料的保守序列相對于對照材料縮短,使蛋白結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。

        2.4 棉花纖維相關(guān)基因Gh14-3-3保守區(qū)域及結(jié)構(gòu)分析

        由三級結(jié)構(gòu)分析可以看出,突變前后的蛋白均屬于Gh14-3-3蛋白家族,突變前的蛋白結(jié)構(gòu)屬于該家族典型的結(jié)構(gòu),具有9個(gè)α-螺旋,而突變后的蛋白結(jié)構(gòu)由于編碼框長度的改變,最終變?yōu)?個(gè)α-螺旋。對照與誘變材料Gh14-3-3蛋白在親水與疏水性方面的差異不明顯,屬于疏水性蛋白(圖8)。

        L-1:對照材料;L-2:石引150材料;L-3:石引200材料;L-4:石引250材料L-1: Control;L-2:Shiyin150;L-3:Shiyin200;L-4:Shiyin 250圖5 誘變與對照材料Gh14-3-3L基因氨基酸序列差異Fig.5 The amino acid sequence compairson of Gh14-3-3L between control and mutant materials

        A.誘變材料Gh14-3-3基因保守區(qū)域; B. 對照材料Gh14-3-3基因保守區(qū)域A.Mutant materials; B. Control圖6 誘變與對照材料Gh14-3-3L基因保守區(qū)域分析差異Fig.6 TheGhI4-3-3Lgene conservative region comparison of mutagenic and control material

        A.對照材料Gh14-3-3基因蛋白;B~C. 誘變材料Gh14-3-3基因蛋白A.Control; B-C.Mutant material圖7 對照材料和誘變材料Gh14-3-3L蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 The tertiary structure comparison of Gh14-3-3L protein between control and mutagenic material

        2.5 對照與誘變材料纖維數(shù)據(jù)比較

        連續(xù)3年(2015-2017)測定對照與誘變材料的纖維長度數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)石引200絨長數(shù)據(jù)分析與對照存在差異性,石引150和石引250絨長數(shù)據(jù)與對照沒差異性,數(shù)據(jù)結(jié)果與SNP位點(diǎn)和測序數(shù)據(jù)存在一致性,推斷可能與石引200材料SNP位點(diǎn)數(shù)較其它兩個(gè)材料多1個(gè)有關(guān),具體關(guān)聯(lián)性待進(jìn)一步驗(yàn)證。

        3 討 論

        傳統(tǒng)的育種手段與現(xiàn)代生物育種技術(shù)相比仍比較原始和落后,使育種水平的提高受到很大限制,同時(shí),由于受到棉花品種內(nèi)在和外在條件的限制,育種周期較長,制約了培育新品種的速度。因此,如何加快棉花的育種速度,是多少年來育種家一直渴望解決的問題,也是當(dāng)前擺脫育種困境的關(guān)鍵,擬南芥TILLING[17]計(jì)劃的成功實(shí)施,帶動(dòng)了多種作物TILLING 檢測服務(wù)系統(tǒng),這些專項(xiàng) TILLING 計(jì)劃,通過建立標(biāo)準(zhǔn)化的 TILLING技術(shù)平臺,共享突變體網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源,提高了突變檢測效率,降低成本,可以有效地服務(wù)于科研及企事業(yè)單位,提高TILLING 技術(shù)應(yīng)用效率。隨著越來越多物種基因組序列的破譯,將會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大 TILLING 技術(shù)的物種檢測范圍及其更多的目標(biāo)基因,這為TILLING 技術(shù)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[5-6,8,17]。本文通過探索TILLING 技術(shù)在新疆早熟陸地棉種質(zhì)創(chuàng)新過程中的關(guān)鍵問題,構(gòu)建可靠的TILLING 技術(shù)體系,同時(shí)借助于這種技術(shù)篩選出一些在抗逆與品質(zhì)性狀方面具有利用價(jià)值的新種質(zhì),為相應(yīng)的栽培品種選育及研究提供新的種質(zhì),拓展新疆棉花種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。

        A.Gh14-3-3蛋白親水性圖示;B.Gh14-3-3蛋白疏水性圖示A. The hydrophilicity of Gh14-3-3L;B. The Hydrophobicity of Gh14-3-3L圖8 對照材料和誘變材料Gh14-3-3L蛋白親疏水性Fig.8 The hydrophilicity and hydrophobicity comparison of Gh14-3-3L gene protein between control and mutant material

        圖9 對照材料和誘變材料纖維數(shù)據(jù)差異顯著性分析Fig.9 The significant difference analysis of fiber data between control and mutagenic material

        4 結(jié) 論

        通過對前期獲得誘變材料進(jìn)行表型性狀與分子水平的驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)采用獲得的誘變體系和鑒定技術(shù)創(chuàng)制棉花種質(zhì)具有可行性,所得材料在表型性狀及分子水平方面都發(fā)生了變異,并且變異位點(diǎn)與表型性狀的變異具有關(guān)聯(lián)性,研究結(jié)果能夠?yàn)樯钊胙芯縏ILLING技術(shù)在棉花及其它植物種質(zhì)資源創(chuàng)制方面提供理論依據(jù)和技術(shù)。

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