穆曉雅，譚志瓊，劉 銅，彭正強(qiáng)，張榮意*

(1.熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101)

【研究意義】黃瓜(CucumissativusL.)葫蘆科黃瓜屬一年蔓生草本植物，是我國重要的栽培蔬菜之一。黃瓜生長周期長，易受各種病害累積量大，黃瓜細(xì)菌性病害時(shí)常發(fā)生?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)已報(bào)道由胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacteriumcarotovorumsub sp.brasiliense)引起的黃瓜細(xì)菌性軟腐病[1]、丁香假單胞菌流淚致病變種(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)引起的黃瓜細(xì)菌性角斑病[2]、野油菜黃單胞菌黃瓜致病變種(Xanthomonascampestrispv.cucurbitae)引起的黃瓜細(xì)菌性葉斑病[3]。由于黃瓜細(xì)菌性病害傳播速度快，如果病害發(fā)生會(huì)造成嚴(yán)重的損失。黃瓜作為中國南繁瓜菜科研育種的主要作物之一，各種黃瓜種植及育種在海南南繁區(qū)匯聚，而各種細(xì)菌性病害可以隨著種子傳播，使得南繁區(qū)域極易成為黃瓜細(xì)菌性病害的傳播和擴(kuò)散的源頭，對(duì)南繁瓜菜科研育種的健康發(fā)展構(gòu)成了潛在的威脅，甚至影響到全國黃瓜用種安全。【本研究切入點(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)在海南南繁區(qū)調(diào)查黃瓜病害時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)菌性病害，一些品種發(fā)病率達(dá)90 %。論文“First Report of Bacterial Leaf Spot of Cucumber Caused byP.cichoriiin China” Plant Disease 已在線發(fā)表。目前化學(xué)藥劑防治是黃瓜細(xì)菌性病害的主要防治辦法，由于化學(xué)藥劑使用次數(shù)多，用藥量大，不僅使病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且容易造成環(huán)境污染，對(duì)人類的健康以及其他生物生長均形成了一種潛在的威脅[4]。生物防治現(xiàn)成為人們研究的重點(diǎn)。許多生物制劑已經(jīng)在防治中取得了顯著效果。由于黃瓜新的細(xì)菌性病害生防研究在國內(nèi)外還未見報(bào)道，由此本文開展了對(duì)黃瓜新的病原菌菊苣假單胞的拮抗菌篩選鑒定的研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過抑菌圈試驗(yàn)篩選出對(duì)黃瓜葉斑病具有拮抗作用的菌株，通過形態(tài)學(xué)、生理生化測(cè)定、16S rDNA以及gyrA基因序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)該拮抗細(xì)菌進(jìn)行鑒定，最后對(duì)此拮抗細(xì)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究，為黃瓜一種新的葉斑病病原菌的生防制劑研發(fā)提供菌種資源，為有效控制黃瓜葉斑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤樣品從海南、安徽、浙江等地采集。供試病原菌為海南大學(xué)植病生防課題組分離、鑒定的黃瓜葉斑病病原菌菊苣假單胞(P.cichorii)。生理生化試驗(yàn)對(duì)照菌株為海南大學(xué)植病生防課題組分離、鑒定的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。固體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[5](NA培養(yǎng)基)，液體培養(yǎng)基為不加瓊脂的NA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌的分離與純化 采用《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[6]中的操作方法分離、純化拮抗細(xì)菌。

1.2.2 拮抗菌抑菌效果測(cè)定 采用抑菌圈法[7]篩選具有拮抗作用的細(xì)菌：將培養(yǎng)24 h的黃瓜葉斑病病原菌菌液倒入熔融狀態(tài)下的NA培養(yǎng)基中(溫度55 ℃左右)。充分混均后倒平板，將之前分離出的的細(xì)菌接在上述帶菌平板上，3次重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 (1)菌株的形態(tài)以及生理生化性狀測(cè)定。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]，對(duì)拮抗細(xì)菌的生理生化性狀進(jìn)行測(cè)定，為保證試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)照菌株也一起進(jìn)行測(cè)定。

(2)菌株16S rDNA序列測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA,16S rDNA的PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物:(27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[9]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:2×PCR-Mixture 12.5 μl，引物各0.5 μl，總DNA 1 μl，dd H2O 10.5 μl，總體積25 μl。PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ℃ 5 min；變性，94 ℃ 1 min；退火，50 ℃ 1 min；延伸，72 ℃ 1.5 min；30個(gè)循環(huán)后終止延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并通過MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法采用Neighbor-join，自展數(shù)(Bootstrap)[10]為1000。

(3)菌株gyrA基因序列測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。根據(jù)文獻(xiàn)[11]選擇高變異性蛋白酶促旋酶gyrA基因序列進(jìn)行分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。gyrA基因引物：(L100：5′-AAATCTGCCCGTATCGTCG-3′；R836：5′-GCGTCACGGCGRATCTCAA-3′)[12]。PCR反應(yīng)體系同上。PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ℃ 3 min；變性，94 ℃ 40 s；退火，61.7 ℃ 40 s；延伸，72 ℃ 25 s；30個(gè)循環(huán)后終止延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序后的結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并通過MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵條件的研究 ①最適pH的測(cè)定。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[7]測(cè)定拮抗細(xì)菌的最適pH：配制pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11的NA培養(yǎng)基，將拮抗菌稀釋液涂布在不同pH的平板上。28 ℃培養(yǎng)，觀察平板上菌落數(shù)并記錄。②最適碳、氮源的測(cè)定。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]配制碳源、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將拮抗菌接入上述培養(yǎng)液基，在28 ℃轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中搖至48 h，采用紫外吸收比濁法[13](600 nm)測(cè)定吸光度，以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照。③最適溫度的測(cè)定。將拮抗菌株接在NA培養(yǎng)液中，放在轉(zhuǎn)速為150 r/min溫度分別為20、25、30、35、40和45 ℃的搖床中，48 h后測(cè)定其吸光度，以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照。④最適轉(zhuǎn)速的測(cè)定。將拮抗菌株接在NA培養(yǎng)液中，放在溫度為28 ℃轉(zhuǎn)速分別為90、120、150、180和220 r/min的搖床中，48 h后測(cè)定其吸光度，以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從采集的土壤中分離到650株細(xì)菌，以1種新的黃瓜葉斑病病原菌菊苣假單胞菌為目標(biāo)菌株，通過抑菌圈法篩選得到10株具有拮抗作用的細(xì)菌，將其中具有較好拮抗效果的菌株編號(hào)為菌株JNL。

2.2 拮抗細(xì)菌的抑菌效果以及形態(tài)特征

從圖1可以看出，菌株JNL對(duì)黃瓜葉斑病病原菌菊苣假單胞具有拮抗作用。JNL菌落圓形，邊緣不整齊，半透明，質(zhì)軟，易挑起。3 d后，菌落表面出現(xiàn)褶皺，質(zhì)地硬，不透明，乳白色，不易挑起。

圖1 菌株JNL抑菌效果Fig.1 Bacterial effect of strain JNL

2.3 菌株生理生化特性

根據(jù)菌株形態(tài)特征以及表1的生理生化特性測(cè)定結(jié)果，對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可以初步確定菌株JNL為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

16S rDNA及gyrA基因同源性分析。拮抗細(xì)菌的16S rDNA基因片段大小為1453 bp。在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)其與解淀粉芽孢桿菌在同一分支。將數(shù)據(jù)上傳至NCBI中，得到該菌株登錄號(hào)為MH588397。菌株JNLgyrA基因片段大小為713 bp，將數(shù)據(jù)上傳至NCBI中，得到登錄號(hào)為MH982189。用NCBI軟件比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后，圖3顯示其與解淀粉芽孢桿菌在同一分支。綜合考慮菌株JNL的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rDNA以及gyrA基因的比對(duì)結(jié)果。菌株JNL鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

表1 菌株JNL生理生化特性

注：表中“+”表示陽性，“-”表示陰性。

Note: ‘+’ indicates positive in the table and ‘-’ indicates negative.

圖2 菌株JNL基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the strain JNL based on 16S rDNA sequence

圖3 菌株JNL基于gyrA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of the strain JNL based on genegyrAnucleotide sequences

2.4 拮抗菌發(fā)酵條件的分析

2.4.1 最適pH測(cè)定 由圖4可見，菌株JNL對(duì)酸堿環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在pH 4.0～11.0的范圍內(nèi)均可生長，在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)生長情況最好，最適pH為7.0。

圖中小寫字母不同表示差異顯著(P≤0.05)，下同The difference in lowercase letters in the figure indicates significant difference (P≤0.05),the same as below圖4 菌株JNL在不同pH下的生長情況Fig.4 Growth of strain JNL at different pH

2.4.2 最適碳源、氮源測(cè)定 由圖5～6可見，菌株JNL在碳源為葡糖糖、棉子糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖時(shí),在氮源為脲、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀時(shí)均可生長，其中當(dāng)?shù)词锹然@、硝酸銨時(shí)，不存在差異顯著性。其最適碳源為半乳糖，氮源為硝酸鉀。

圖5 菌株JNL在不同碳源下的生長情況Fig.5 Growth of strain JNL under different carbon sources

圖6 菌株JNL在不同氮源下的生長情況Fig.6 Growth of strain JNL under different nitrogen sources

2.4.3 最適溫度的測(cè)定 由圖7可見，菌株JNL最適生長溫度為30 ℃，在溫度下降或上升時(shí)，其生長效果均減弱。且不同溫度之間存在顯著性差異。

2.4.4 最適轉(zhuǎn)速的測(cè)定 由圖8可見，菌株JNL在轉(zhuǎn)速上升或者下降時(shí)，其生長效果均有所下降。其最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。且不同搖床轉(zhuǎn)速之間存在顯著性差異。

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，在形態(tài)學(xué)上很難對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類，因此屬種主要根據(jù)生理生化特性和16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定，但是由于枯草芽孢桿菌近緣種群分類變化速度快，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)及暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)等。對(duì)該群菌株準(zhǔn)確鑒定的難度越來越大，因此只有把傳統(tǒng)的方法與先進(jìn)的分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才能對(duì)該群菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定[11]。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)定與16S rDNA以及gyrA基因序列分析相結(jié)合的方法對(duì)枯草群進(jìn)行了有效區(qū)分，最終將菌株JNL鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

芽孢桿菌內(nèi)生芽孢，對(duì)不利環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，繁殖速度快，自然界中分布廣泛，并且是一類非致病細(xì)菌。解淀粉芽孢桿菌不僅可以通過分泌次生代謝產(chǎn)物(抑菌蛋白類、脂肽類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類、寡肽酶、肽類和聚酮化合物等)來抑制病原菌的生長，還可通過誘導(dǎo)提高植株自身的抗病能力。解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物病原細(xì)菌有顯著的防治效果，可以作為生物農(nóng)藥來適當(dāng)替代化學(xué)農(nóng)藥使用[14]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)從海南、安徽、浙江等地的土壤中分離出一株對(duì)新的黃瓜細(xì)菌性葉斑病的病原菌菊苣假單胞具有拮抗作用的菌株。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化性狀測(cè)定、16S rDNA同源性序列分析以及gyrA基因序列分析，確定菌株JNL為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。通過單因子變量法測(cè)定菌株JNL在pH為7、溫度為30 ℃、碳源為半乳糖、氮源為硝酸鉀、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下生長效果最好。

圖7 菌株JNL在不同溫度下的生長情況Fig.7 Growth of strain JNL at different temperatures

圖8 拮抗菌JNL在不同轉(zhuǎn)速下的生長情況Fig.8 Growth of antagonistic antibacterial JNL at different speeds

拮抗菌JNL對(duì)一種新的黃瓜細(xì)菌性葉斑病的病原菌菊苣假單胞具有拮抗作用。為微生物農(nóng)藥開發(fā)奠定了菌源基礎(chǔ)，對(duì)減少黃瓜細(xì)菌性葉斑病病害，增加黃瓜產(chǎn)量具有一定的研究意義。