趙宜婷,武麗霞,詹曉平,鄧文麗,黃吳瑩, 魯新琪,韓 麗,周 璇,杜云龍*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

【研究意義】根系作為植株的地下部分，在植物生長發(fā)育過程中起到非常重要的作用。月亮谷(Acuce) 水稻是元陽梯田的特色地方稻，開展植物激素對(duì)月亮谷水稻的根系研究，對(duì)于揭示激素對(duì)水稻根系發(fā)育的調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義，能充分了解根系發(fā)育與月亮谷的優(yōu)異性狀之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)開展新品種選育具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，開展月亮谷水稻根系發(fā)育的研究，對(duì)提高元陽梯田土地資源的利用、促進(jìn)糧食增產(chǎn)、保護(hù)元陽梯田的持續(xù)發(fā)展是一個(gè)有效的手段。【前人研究進(jìn)展】生長素在植物根系發(fā)育中起到一個(gè)核心的作用，許多研究揭示了生長素可調(diào)控水稻胚根[1]、不定根[2]和根毛發(fā)育。生長素的極性分布對(duì)植物發(fā)育具有重要作用[3]，水楊酸可通過抑制細(xì)胞胞吞而影響生長素的極性運(yùn)輸[4]調(diào)節(jié)擬南芥下胚軸的發(fā)育及向光性[5]。水楊酸(Salicylic acid，SA)作為一種重要的植物激素，廣泛參與植物抗病、抗逆、植株衰老、果實(shí)成熟、種子萌發(fā)、花發(fā)育等重要生命過程的調(diào)控[6]。水楊酸與水稻生長發(fā)育的研究，長期以來集中于其誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性的方面[7]，但一些研究結(jié)果顯示出水楊酸可能直接或間接參與了對(duì)植物根系發(fā)育的調(diào)控，例如水稻中的OsWRKY03作為依賴于水楊酸或茉莉酸防御反應(yīng)途徑中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活物，過表達(dá)OsWRKY03明顯減少了水稻根發(fā)育的起始及伸長[8]。真菌及病毒性病害對(duì)水稻生長發(fā)育的危害日趨嚴(yán)重[9-10]。月亮谷(Acuce)是云南元陽哈尼梯田上種植面積最大的地方稻，已有100多年的種植歷史。月亮谷屬于農(nóng)家水稻品種，研究發(fā)現(xiàn)月亮谷水稻具有抗病性強(qiáng)、較強(qiáng)耐冷能力和產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)異的農(nóng)藝性狀[11]，并具有較高的遺傳異質(zhì)性[12]和居群遺傳多樣性[13]及遺傳變異性[14]。UV-B的輻射可抑制月亮谷葉片的發(fā)育[15]，而在月亮谷的根系中能夠分離到熒光假單胞菌[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)月亮谷水稻根系機(jī)制的研究還未見相關(guān)的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究，將揭示SA與生長素相互作用調(diào)控月亮谷水稻根系發(fā)育的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

月亮谷水稻來自云南元陽梯田，為本實(shí)驗(yàn)室保存材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水稻材料組織培養(yǎng) 月亮谷水稻種子去殼，種子用70 % 無水乙醇表面消毒90 s；無菌水清洗1次，之后用20 % 次氯酸鈉溶液浸泡14 min，無菌水清洗5次；用滅菌濾紙將多余水分吸干，將處理好的種子置于1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 水楊酸處理月亮谷水稻 種子去殼后，在1/2 MS培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)2 d至種子萌發(fā)。萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)至含有0.5、1、1.5、2 mM SA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)照組為含有等量二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的1/2 MS培養(yǎng)基，種子在28 ℃人工氣候箱中進(jìn)行黑暗8 h和光照16 h的培養(yǎng)，7 d后，對(duì)胚根、不定根、側(cè)根進(jìn)行測(cè)量分析。

1.2.3 重力刺激條件下的月亮谷水稻生長 月亮谷水稻種子在28 ℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)2 d后，光照培養(yǎng)4 d。水稻苗轉(zhuǎn)移至含有SA(0.5、1、1.5、2 mM)的1/2 MS培養(yǎng)基上，同時(shí)將培養(yǎng)平板逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，在光照條件下培養(yǎng)18、24、48、72、96 h，觀察胚根發(fā)育。

1.2.4 月亮谷水稻中生長素運(yùn)輸檢測(cè) 月亮谷水稻種子在1/2 MS培養(yǎng)基上萌芽1 d后，轉(zhuǎn)至含有DMSO、100 μM SA、5 μM N-(1-萘基)鄰氨甲酰苯甲酸[N-(1-Naphthyl) phthalamic Acid，NPA]、5 μM NPA+ 100 μM SA的1/2 MS培養(yǎng)基上，分別測(cè)量統(tǒng)計(jì)光照培養(yǎng)18、24、48、72、96 h后的胚根長度。

月亮谷水稻種子在1/2 MS培養(yǎng)基上萌芽2 d后，轉(zhuǎn)至含有DMSO、100 μM SA的1/2 MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)5 d后，在重力刺激條件下培養(yǎng)18 h，之后取與地面平行的胚根部分，用HPLC-MS/MS的方法檢測(cè)生長素的含量。

1.2.5 月亮谷水稻根中胞吞觀察 月亮谷水稻苗經(jīng)光照培養(yǎng)4 d后，胚根的根尖用4 μM FM4-64、100 μM SA(等體積DMSO為對(duì)照)及 25 μM 布雷非德菌素A (Brefeldin A，BFA)溶液共處理90 min，在激光共聚焦顯微鏡Leica SP5(所用參數(shù)：40倍放大，Zoom: 2，F(xiàn)rame: 4，Agron: 488 nm，)下觀察，并用Image J軟件測(cè)量BFA 小體的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對(duì)月亮谷水稻根系的影響

為了揭示SA對(duì)水稻根系發(fā)育的影響，月亮谷水稻用不同濃度SA處理，與經(jīng)DMSO處理的對(duì)照相比，隨著SA濃度的增加，月亮谷水稻胚根的生長受到明顯抑制(圖1)，側(cè)根數(shù)量減少(圖2)。當(dāng)SA濃度達(dá)到2 mM時(shí)，不定根的發(fā)育受到明顯抑制(圖3)，說明SA的處理影響了水稻的根系發(fā)育。

P<0.05，**P<0.01 (Student’st-test)，下同。DMSO：DMSO處理；SA 0.5，SA 1，SA 1.5，SA 2：水稻苗分別用濃度為0.5、1、1.5、2 mM的SA處理DMSO treatment; SA 0.5, SA 1, SA 1.5, SA 2: rice seedlings treated with SA at a concentration of 0.5, 1, 1.5 and 2 mM, respectively圖1 SA對(duì)月亮谷水稻胚根長度的影響Fig.1 Effect of SA on the primary root length of Acuce rice

圖2 SA對(duì)月亮谷水稻側(cè)根數(shù)量的影響Fig.2 Effect of SA on the number of lateral root of Acuce rice

圖3 SA對(duì)月亮谷水稻不定根數(shù)量的影響Fig.3 Effect of SA on the number of adventitious root of Acuce rice

Bar = 1 cm；g：重力，箭頭指示重力方向。下同Bar = 1 cm; g: gravity，arrow showed the direction of gravity. The same was below圖4 重力刺激下的月亮谷水稻胚根及側(cè)根發(fā)育Fig.4 Development of primary root and lateral root of Acuce rice under gravity stimulation

圖5 重力刺激下SA對(duì)月亮谷水稻側(cè)根密度的影響Fig.5 Effect of SA on the lateral root density of Acuce rice under gravity stimulation

圖6 重力刺激下SA對(duì)月亮谷水稻根彎曲度的影響Fig.6 Effect of SA on the root curve of Acuce rice under gravity stimulation

2.2 SA改變生長素分布

生長素的極性分布可以影響根系的生長[3]。為了探究SA影響月亮谷水稻根系發(fā)育是否與生長素分布有關(guān)，月亮谷水稻在含有SA (0.5、1、1.5、2 mM )的1/2 MS培養(yǎng)基生長并經(jīng)重力刺激(圖4)，結(jié)果顯示隨著SA濃度的增加，與地面平行的胚根上，側(cè)根密度明顯降低(圖5)。與對(duì)照相比，在低濃度SA(0.5 mM)處理下，胚根的彎曲開始明顯變小(圖4，圖6)。當(dāng)SA濃度升高到1 mM 時(shí)，胚根的生長與水平面呈平行狀態(tài)(圖4，圖6)。說明SA的處理會(huì)改變生長素的分布，使得水稻根系的生長發(fā)育受到影響。

2.3 水楊酸影響月亮谷水稻根中的生長素運(yùn)輸

為了進(jìn)一步揭示SA影響水稻根系發(fā)育與生長素分布之間的關(guān)系，用生長素運(yùn)輸抑制劑NPA處理月亮谷水稻。當(dāng)采用低濃度SA(0.1 mM)處理水稻時(shí)，與經(jīng)DMSO處理的水稻相比(圖7)，胚根的生長沒有受到明顯的影響(圖8)。但是，用生長素運(yùn)輸抑制劑NPA(5 μM)處理后，與用DMSO及SA(0.1 mM)處理的水稻相比(圖7)，水稻胚根長度明顯變短(圖8)。當(dāng)用NPA(5 μM)與SA(0.1 mM)同時(shí)處理水稻時(shí)，與經(jīng)NPA處理的水稻相比(圖7)，月亮谷胚根的長度明顯伸長(圖8)。同時(shí)，在重力刺激條件下，水稻經(jīng)0.1 mM SA處理(圖9)，測(cè)量水稻胚根中的IAA含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SA(0.1 mM)處理的月亮谷胚根中的IAA含量明顯升高(圖10)。這些結(jié)果顯示SA影響了生長素的運(yùn)輸而調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育。

DMSO：DMSO處理；SA 100：水稻苗用濃度為100μM的SA處理；NPA 5：水稻苗用濃度為5μM的NPA 處理；NPA 5 + SA 100：水稻苗用濃度為 100 μM的SA和5 μM的NPA 同時(shí)處理。下同DMSO:DMSO treatment; SA 100: Rice seedlings treated with 100 μM SA; NPA 5:Rice seedlings treated with 5 μM NPA; NPA 5 + SA 100:Rice seedlings treated with 100 μM SA and 5 μM NPA. The same as below圖7 不同培養(yǎng)基處理下月亮谷水稻胚根的表型Fig.7 The phenotype of primary root of Acuce rice treated with different media

圖8 不同培養(yǎng)基對(duì)月亮谷水稻胚根長度的影響Fig.8 Effect of different media on the primary root length of Acuce rice

IAA，測(cè)量橫向生長胚根中的生長素含量IAA, measurement of auxin content in the horizontal primary root圖9 月亮谷水稻重力刺激示意圖Fig.9 The schematic diagram of gravity stimulation on Acuce rice

圖10 SA處理月亮谷水稻胚根后的生長素含量Fig.10 Auxin content in the primary root of Acuce rice treated with SA

2.4 水楊酸抑制水稻根表皮細(xì)胞的胞吞

水楊酸可以抑制網(wǎng)格蛋白clathrin介導(dǎo)的胞吞，從而調(diào)節(jié)生長素的運(yùn)輸[4]。生長素輸出蛋白的不對(duì)稱分布可以調(diào)節(jié)生長素的極性分布，從而有利于生長素的運(yùn)輸。在水稻中，生長素輸出蛋白相關(guān)基因已經(jīng)被鑒定[2,17-18]。蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑brefeldin A (BFA)處理植物細(xì)胞后，可抑制膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)而在細(xì)胞質(zhì)中形成BFA小體(BFA body)，并能觀察細(xì)胞的胞吞[3-4]。為了揭示水楊酸是否通過抑制細(xì)胞胞吞而調(diào)節(jié)生長素運(yùn)輸，月亮谷水稻胚根經(jīng)水楊酸、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA以及細(xì)胞膜染料FM4-64共同處理，在激光共聚焦顯微鏡下觀察根表皮細(xì)胞的胞吞(圖11)，顯示低濃度水楊酸可以明顯抑制根表皮細(xì)胞的胞吞(圖12)。

3 討 論

激素間的相互作用對(duì)于植物的生長發(fā)育起到重要的作用。SA參與調(diào)控植物的生長發(fā)育，但是，SA對(duì)根系發(fā)育的調(diào)控機(jī)制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的水楊酸能夠抑制月亮谷水稻根系的發(fā)育，而較低濃度的水楊酸已能抑制月亮谷水稻根中的生長素運(yùn)輸，這與水楊酸抑制根表皮細(xì)胞的胞吞密切相關(guān)。生長素的極性分布調(diào)控根系發(fā)育[1]。在重力刺激條件下，水楊酸對(duì)胚根彎曲和側(cè)根發(fā)育的影響與其濃度呈現(xiàn)相關(guān)性，但是，低濃度水楊酸處理已能影響生長素在胚根中的分布，這顯示水楊酸改變了生長素的運(yùn)輸。在擬南芥中，觀察到水楊酸阻止了根的伸長、側(cè)根的起始和根毛的形成[19]。而水楊酸影響擬南芥根的波動(dòng)生長可能與水楊酸受體NPR1及一氧化氮相關(guān)蛋白AtNOA1有關(guān)[20]。但是，試驗(yàn)未觀察到水楊酸對(duì)水稻根波動(dòng)生長的明顯影響，這暗示水楊酸可通過影響生長素的極性分布而調(diào)控根系發(fā)育，但水楊酸調(diào)控植物根系的生長在單子葉植物水稻和雙子葉植物擬南芥上仍存在一定的差異。生長素的極性分布與生長素輸出載體蛋白的分布密切相關(guān)[3]。SA能夠抑制擬南芥根表皮細(xì)胞中生長素輸出載體蛋白的胞吞，從而改變生長素的運(yùn)輸[4]。在水稻中存在不同的生長素輸出載體蛋白，它們可定位于質(zhì)膜、根冠、中柱鞘細(xì)胞、分生組織及側(cè)根原基，其表達(dá)及細(xì)胞定位受到生長素及其它激素的調(diào)控[2,17]。水稻中的生長素輸出載體蛋白也可調(diào)節(jié)生長素在水稻中的分布[2,17-18]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SA的處理抑制了月亮谷水稻根表皮細(xì)胞的胞吞，這顯示SA對(duì)植物細(xì)胞胞吞的抑制作用在單子葉與雙子葉植物中具有一定的保守性。因此，推測(cè) SA具有抑制水稻中生長素輸出載體蛋白胞吞的作用，并改變了生長素運(yùn)輸?？紤]到水稻中生長素輸出載體蛋白的多樣性，還有待檢測(cè)水稻根中的生長素輸出載體蛋白在受到SA影響時(shí)的細(xì)胞定位情況，以確定水稻中特異生長素輸出載體蛋白與SA互作調(diào)控水稻根系發(fā)育的機(jī)理。

Bar：10 μm，箭頭指出BFA小體。BFA 25：水稻根用濃度為25 μM的BFA處理；SA 100 + BFA 25：水稻根用濃度為25 μM的BFA和100 μM的SA共同處理Bar: 10 μm, arrow head pointed out the BFA body; BFA 25:rice root treated with 25 μM BFA; SA 100 + BFA 25: rice root treated with 100 μM SA and 25 μM BFA圖11 SA抑制月亮谷水稻根表皮細(xì)胞的胞吞Fig.11 Inhibition of endocytosis by SA in the root epidermis cells of Acuce rice

圖12 不同處理下BFA小體的大小Fig.12 Relative size of BFA body on different treatments

4 結(jié) 論

研究結(jié)果說明，SA可通過抑制生長素輸出載體蛋白的胞吞進(jìn)而干擾生長素的極性運(yùn)輸，并影響月亮谷水稻的根系發(fā)育。