羅瑜平，文敏，熊江福，周波，艾戎，童雪濤

(1貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

孤獨癥是一種異質性綜合征，主要表現(xiàn)為社交互動、語言和興趣范圍的三個核心行為障礙[1]。目前，孤獨癥的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，大量研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥發(fā)病與突觸功能障礙有關[2]。突觸功能的維持需要一定的興奮性與抑制性回路的平衡，海馬中興奮性與抑制性突觸失衡與神經發(fā)育障礙疾病相關，如孤獨癥、精神分裂癥等[3]。早期在孤獨癥中發(fā)現(xiàn)，神經元過度興奮和γ-氨基丁酸(GABA)能信號傳導減弱，即興奮性突觸聚集、抑制性突觸減少，出現(xiàn)興奮性與抑制性突觸失衡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與突觸形成及突觸連接間的建立[5]。增強自噬可促進神經系統(tǒng)中異常蛋白質聚集的消除[6]。自噬的增強可改善孤獨癥癥狀[7]。因此我們假設，孤獨癥大鼠海馬組織中興奮性、抑制性突觸蛋白失衡，自噬可通過影響興奮性、抑制性突觸蛋白的表達，恢復海馬組織中興奮性、抑制性突觸失衡，改善孤獨癥癥狀。2017年3月～2018年6月，我們檢測了自噬干預前后孤獨癥大鼠海馬組織突觸素(Syn)、興奮性突觸[突觸后致密蛋白95(PSD-95)]和抑制性突觸[橋尾蛋白(Gephyrin)]的表達變化，探討自噬對孤獨癥大鼠海馬組織興奮性、抑制性突觸相關蛋白表達的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康繁殖期Wistar雌鼠20只(體質量250～260 g)和雄鼠10只(體質量270～280 g)，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。丙戊酸(VPA)(P4543)購自美國Sigma公司；雷帕霉素(R-5000)購自上海睿鉑賽生物科技有限公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)(HY-19312)購自MCE公司；(BCA)蛋白質定量試劑盒、RIPA裂解液、β-actin兔抗鼠多克隆抗體(bs-0061R)均購自北京博奧森生物技術有限公司；Syn兔單克隆抗體(BM4152)購自武漢博士德生物技術公司，PSD-95兔多克隆抗體(#3409)購自美國CST公司，Gephyrin兔單克隆抗體(EPR12650)購自美國Abcam公司。

1.2 孤獨癥模型建立 參考Schneider等[8]建模方法，取20只雌鼠和10只雄鼠，晚7時將雌雄鼠按2∶1的比例合籠過夜，實驗動物用苦味酸標記。第2天早晨對雌鼠的陰道涂片觀察，如受精則標記為妊娠(E)第1天(E1)。在E12.5時，取10只孕鼠給予250 g/L的VPA(600 mg/kg)腹腔注射，產下的后代鼠作為VPA干預組；另取5只孕鼠同時點通過腹腔注射等劑量生理鹽水，產下的后代鼠作為對照組。取生后第7～10天的后代鼠行負向性實驗，示VPA干預組后代鼠的方向感及運動機能總體低于對照組后代鼠，表明孤獨癥模型建立成功。

1.3 動物分組及干預方法 以后代鼠出生當天為生后第1天(P1)，于P35時，從VPA干預組中隨機取30只分為模型組、自噬抑制組(3-MA組)和自噬增強組(Rap組)，每組各10只，分別一次性腹腔注射生理鹽水、3-MA 5 mg/kg和雷帕霉素5 mg/kg；同時，對照組后代鼠10只腹腔注射同等劑量生理鹽水。

1.4 刻板重復行為評價 采用自梳理實驗。P42時，將每組大鼠置于標準鼠盒(30 cm×25 cm×20 cm)中，盒底于1 cm敷料覆蓋，以阻止大鼠挖掘盒底。大鼠在盒內適應5 min后，觀察大鼠的行為；用秒表計數(shù)10 min內自身梳理各個部位的總時間(以下簡稱為梳理時間)，評價大鼠的刻板重復行為。

1.5 社交能力評價 采用三箱實驗。自制木箱120 cm×45 cm×50 cm，木箱中間由兩塊板隔開，中間格長度為60 cm，每邊長30 cm。兩塊板下方均有一個開口，允許實驗鼠自由通過。分為三個步驟(每個階段記錄10 min)：①P42時，將測試大鼠放入籠中，允許自由通過每個格子；②前10 min：將同一性別的未與測試大鼠接觸的陌生鼠1引入其中一個側室，另一個側室則為空鼠籠；③后10 min：陌生鼠1仍然在籠子的一側，籠子的另一側是一只新的不熟悉的大鼠(陌生鼠2)。在其他環(huán)境條件一致的情況下，記錄大鼠前后10 min分別在不同格子的停留時間，評價大鼠的社交能力，其中前10 min是社交測試，后10 min是對新鮮事物的好奇行為測試。

1.6 海馬組織病理改變觀察 采用HE染色法。P42時處死大鼠，取各組海馬組織，脫水、石蠟包埋，冠狀切片后在顯微鏡下觀察海馬組織病理改變。

1.7 海馬組織Syn、PSD-95、Gephyrin蛋白表達檢測 ①采用免疫組化法檢測。取各組海馬組織，脫水、石蠟包埋，免疫組化可見陽性細胞的細胞膜染成棕色，采用陽性細胞百分比與染色強度相結合計算積分，對免疫組化結果進行評判[9]。②采用Western blotting法進行蛋白半定量檢測。P42時，將各組大鼠在冰上斷頸處死，迅速取海馬組織，稱重后放入EP管中，加入RIPA裂解液后提取蛋白。測總蛋白濃度，取40 μg總蛋白樣品于10%十二烷基硫酸鈉-聚炳烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干轉方法將蛋白轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，再加一抗4 ℃過夜(Syn兔抗鼠單克隆抗體1∶500、PSD-95兔抗鼠多克隆抗體1∶1 000、Gephyrin兔抗鼠單克隆抗體1∶2 000、β-actin兔抗鼠多克隆抗體1∶2 000)；次日用TBST洗膜，再加二抗(山羊抗兔IgG 1∶10 000)室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜，ECL發(fā)光液曝光，用Image J軟件進行半定量分析。計算PSD-95/Gephyrin比值。

2 結果

2.1 各組刻板重復行為比較 對照組、模型組、3-MA組、Rap組梳理時間分別為(28.40±9.41)、(49.70±10.29)、(71.40±11.44)、(30.50±9.01)s，模型組梳理時間長于對照組，3-MA組梳理時間長于模型組，Rap組梳理時間短于3-MA組(P均<0.01)。

2.2 各組社交能力比較

2.2.1 社交測試結果 前10 min，與對照組相比，模型組在放有陌生鼠1的格子中停留時間縮短，而在放有空鼠籠的格子中停留時間延長(P均<0.05)。與模型組相比，3-MA組在陌生鼠1的格子中停留時間縮短(P<0.05)，而與在空鼠籠的格子中停留時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Rap組在陌生鼠1的格子中停留時間延長，在空鼠籠的格子中停留時間縮短(P均<0.05)。見表1。

2.2.2 好奇行為測試結果 后10 min，與對照組相比，模型組在放有陌生鼠1的格子中停留時間延長，而在放有陌生鼠2的格子中停留時間縮短(P均<0.05)。與模型組相比，3-MA組在陌生鼠1的格子中停留時間延長，在陌生鼠2的格子中停留時間縮短(P均<0.05)；Rap組在陌生鼠1的格子中停留時間縮短，在陌生鼠2的格子中停留時間延長(P均<0.05)。 見表1。

表1 各組社交能力測試停留時間比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組海馬組織病理改變 HE染色示，對照組海馬組織CA1區(qū)神經元排列整齊、密集，形態(tài)正常；模型組海馬組織CA1區(qū)神經元排列紊亂，出現(xiàn)核固縮，神經細胞數(shù)量減少；3MA組、RAP組可見海馬組織CA1區(qū)上散在核固縮，有不同程度的神經細胞變性。見圖1。

注：a為對照組，b為模型組，c為3-MA組，d為Rap組。

2.4 各組海馬組織Syn、PSD-95、Gephyrin蛋白表達比較

2.4.1 免疫組化法結果 與對照組相比，模型組Syn、PSD-95陽性細胞數(shù)增加，Gephyrin陽性細胞數(shù)減少(P均<0.05)。與模型組相比，Rap組Syn、PSD-95陽性細胞數(shù)減少，Gephyrin陽性細胞數(shù)增加(P均<0.05)；3-MA組Syn、PSD-95陽性細胞數(shù)增加，Gephyrin陽性細胞數(shù)減少(P均<0.05)。見表2、圖2～4。

2.4.2 Western blotting法結果 與對照組相比，模型組海馬Syn、PSD-95蛋白表達均上調，Gephyrin蛋白表達下調(P均<0.05)；與模型組相比，3-MA組Syn、PSD-95蛋白表達均上調，Gephyrin蛋白表達下調(P均<0.05)；與模型組相比，Rap組Syn、PSD-95蛋白表達均下調，Gephyrin蛋白表達水平上調(P均<0.05)。見圖5～7。

表2 各組海馬組織Syn、PSD-95、Gephyrin蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

注：a為對照組，b為模型組，c為3-MA組，d為Rap組。箭頭示陽性細胞。

注：a為對照組，b為模型組，c為3-MA組，d為Rap組。箭頭示陽性細胞。

注：a為對照組，b為模型組，c為3-MA組，d為Rap組。箭頭示陽性細胞。

2.5 各組海馬組織PSD-95/Gephyrin比值比較 與對照組相比，模型組PSD-95/Gephyrin比值上調；與模型組相比，3-MA組PSD-95/Gephyrin比值上調；與模型組相比，Rap組PSD-95/Gephyrin比值下調(P均<0.05)。見圖8。

3 討論

目前普遍認為，發(fā)育過程中神經系統(tǒng)的興奮與抑制過程功能失調與孤獨癥有關[10]。大腦正常的發(fā)育需要一定水平的抑制，如果抑制功能喪失將導致孤獨癥[11]。突觸是連接和傳遞神經元之間或神經元和效應細胞之間的特化結構，大腦功能的正常發(fā)揮基于其結構及數(shù)量的完整性。研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥兒童大腦內存在過多的突觸，一旦用藥物消除這些突觸，可改善孤獨癥行為。Lo等[12]研究表明，興奮性/抑制性回路失衡影響突觸功能是導致孤獨癥發(fā)病的重要原因之一，因此恢復興奮性/抑制性突觸失衡對改善孤獨癥癥狀至關重要。

注：左圖為Western blotting法蛋白表達條帶圖。右圖為各組比較結果，*為與對照組比較，P<0.05；#為與模型組比較，P<0.05。

注：左圖為Western blotting法蛋白表達條帶圖。右圖為各組比較結果，*為與對照組比較，P<0.05；#為與模型組比較，P<0.05。

注：左圖為Western blotting法蛋白表達條帶圖。右圖為各組比較結果，*為與對照組比較，P<0.05；#為與模型組比較，P<0.05。

VPA是作為一種抗癲癇藥在臨床中運用[13]。懷孕期間暴露于VPA已被證明會增加兒童孤獨癥的風險，此外，產前暴露于該藥物的嚙齒動物顯示出人類孤獨癥樣行為表型特征，可能與破壞胚胎大腦發(fā)育的時空窗口相關[14]。因此，本研究參考Schneider等[8]的建模方法，采用VPA進行孤獨癥建模。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠自梳理時間延長，前10 min模型組大鼠在放有陌生鼠1中停留時間較對照組縮短，后10 min在放有陌生鼠2中停留時間也較對照組縮短，表明孤獨癥大鼠出現(xiàn)重復刻板行為及社交能力障礙；模型組海馬CA1區(qū)神經元排列紊亂，出現(xiàn)核固縮，神經細胞數(shù)量減少，表明孤獨癥大鼠中神經細胞結構被破壞，可能與孤獨癥發(fā)病相關。

自噬相關通路被異常誘導，導致自噬活性降低，與孤獨癥相關，雷帕霉素通過抑制異常激活的自噬相關通路，增強自噬可恢復部分孤獨癥樣行為[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，3-MA組梳理時間延長，前10 min 3-MA組大鼠在放有陌生鼠1中停留時間較模型組縮短，后10 min在放有陌生鼠2中停留時間也較模型組縮短，提示抑制自噬可加重重復刻板行為及社交能力障礙；與模型組相比，Rap組梳理時間縮短，前10 min Rap組大鼠在放有陌生鼠1中停留時間較模型組延長，后10 min在放有陌生鼠2中停留時間也較模型組延長，提示增強自噬會減輕重復刻板行為及社交能力障礙。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬可通過調節(jié)蛋白酶體介導的降解途徑調控突觸生長及功能[16]。突觸相關蛋白表達異?？赏ㄟ^自噬途徑降解。突觸包含Syn、興奮性突觸PSD-95和抑制性突觸Gephyrin等。Syn是一種位于突觸囊泡膜上的突觸蛋白，主要用于反映突觸的數(shù)量。PSD-95是在谷氨酸能神經元PSD中發(fā)現(xiàn)的興奮性突觸后膜上腳手架蛋白，只分布于突觸后膜下方的突觸活性區(qū)中，是突觸后的標記分子，參與調節(jié)興奮性和抑制性突觸的平衡[17]。研究發(fā)現(xiàn)，PSD-95發(fā)育和功能異常可導致多種神經精神疾病包括智力低下、自閉癥、精神分裂癥和神經變性病等。Gephyrin是一種突觸后支架蛋白，對抑制性突觸中甘氨酸和γ-氨基丁酸A型受體的聚集至關重要，Gephyrin基因的缺失會導致包括自閉癥譜系障礙、精神分裂癥和癲癇發(fā)作在內的神經發(fā)育障礙性疾病，可能與擾亂了海馬神經元中抑制性突觸的正常的聚集相關[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，增強自噬可促進對Syn的降解，恢復合成與降解間動態(tài)平衡。PSD-95的降解導致了突觸的消失，而清除過剩的PSD-95有利于改善孤獨癥癥狀[19]。并且抑制性突觸的減少可通過增強自噬來逆轉[20]，進一步恢復興奮性/抑制性突觸的平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組海馬Syn、PSD-95蛋白表達及陽性細胞數(shù)均增加，Gephyrin蛋白表達及陽性細胞數(shù)均降低，且PSD-95/Gephyrin比值上調，提示孤獨癥大鼠海馬組織中興奮性突觸增加、抑制性突觸減少，興奮性/抑制性突觸失衡；與模型組相比，3-MA組Syn、PSD-95蛋白表達及陽性細胞數(shù)均增加，Gephyrin蛋白表達及陽性細胞數(shù)均降低，且PSD-95/Gephyrin比值上調，提示抑制自噬可進一步促進海馬組織中興奮性突觸增加、抑制性突觸減少，加重興奮性/抑制性突觸失衡；與模型組相比，Rap組Syn、PSD-95蛋白表達及陽性細胞數(shù)均降低，Gephyrin蛋白表達及陽性細胞數(shù)均增加，且PSD-95/Gephyrin比值下調，提示增強自噬可使海馬組織中興奮性突觸減少、抑制性突觸增加，恢復興奮性/抑制性突觸的失衡。以上結果表明，孤獨癥大鼠中興奮性突觸上調、抑制性突觸下調，興奮性/抑制性突觸失衡；當增強自噬時，恢復了興奮性/抑制性突觸的平衡，改善了孤獨癥癥狀，表明興奮性/抑制性突觸失衡與孤獨癥發(fā)病相關。

綜上所述，自噬影響孤獨癥大鼠的社會行為，孤獨癥大鼠存在興奮性/抑制性突觸失衡，增強自噬可恢復孤獨癥大鼠興奮性/抑制性突觸失衡，從而改善孤獨癥癥狀。