葛一漫，胡一梅，馬韜，張靈玲，雍江堰，張朝明

(1成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都610075；2成都中醫(yī)藥大學(xué))

人體皮膚直接與外界接觸，在一定程度上可以阻止外部環(huán)境中不利因素的侵害，還可防止體內(nèi)水分的丟失。皮膚屏障主要指角質(zhì)層結(jié)構(gòu)相關(guān)的屏障，角質(zhì)層結(jié)構(gòu)主要包含角質(zhì)細胞及細胞間脂質(zhì)。任何改變角質(zhì)層結(jié)構(gòu)蛋白功能、脂質(zhì)正常代謝的因素都可能會導(dǎo)致皮膚屏障功能異常。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性濕疹的發(fā)病及病情的轉(zhuǎn)歸與皮膚屏障功能是否完好密不可分。但急性濕疹疾病中皮膚屏障的異常究竟是破壞了角質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)，還是脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，或者二者兼有尚需進一步證明。2016年1月～2018年12月，本實驗擬通過比較正常大鼠和急性濕疹大鼠皮膚病理改變，探討急性濕疹大鼠發(fā)病與皮膚屏障異常的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑與儀器 SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，由成都達碩動物實驗有限公司提供；2，4-二硝基氯苯(DNCB)(成都科龍化工試劑廠)；AF200皮膚表皮水分喪失測定儀(英國BIOX公司)；一抗PAR-2(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二抗及相應(yīng)試劑盒及陽性片(北京中山金橋生物有限公司)；Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司)

1.2 動物分組及模型建立 采用隨機數(shù)字表法，將20只大鼠按分層隨機法分為正常組、模型組各10只。模型組大鼠腹部、右背部剃毛后，于腹部涂5% DNCB 30 μL進行首次致敏，第3、5、7天于右背部涂0.2% DNCB 50 μL進行抗原攻擊。第9天觀察大鼠造模區(qū)皮膚是否有急性濕疹癥狀，如皮膚上出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、丘皰疹、水皰、糜爛等濕疹樣皮損表現(xiàn)，即為造模成功。

1.3 觀察指標

1.3.1 皮膚組織經(jīng)皮水分丟失量(TEWL) 采用AF200皮膚表皮水分喪失測定儀測量大鼠造模區(qū)皮膚組織3次，取平均值作為TEWL。

1.3.2 皮膚病理改變 采用斷頸法處死大鼠，手術(shù)剪取兩組大鼠右背部皮膚，放入固定液中。石蠟包埋并切片，采用HE染色法觀察組織病理改變，并作病理損傷評分：0分為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)完好清楚，層次分明，未見變性、壞死、過度角化，未見棘層增厚，周圍組織未見水腫及炎細胞，細胞浸潤等病理性改變；1分為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)輕度破壞，層次稍不分明，偶見變性、壞死、輕度角化，偶見棘層增厚，周圍組織偶見水腫及炎細胞，細胞呈灶性浸潤等病理性改變；2分為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)中度破壞，層次不分明，可見變性、壞死、過度角化，可見棘層增厚，周圍組織可見水腫及炎細胞，細胞呈彌漫性浸潤等病理性改變；3分為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)重度破壞，層次不分明，明顯可見變性、壞死、過度角化，棘層增厚，周圍組織有水腫及炎細胞，細胞彌漫性浸潤等病理性改變。

1.3.3 人類中間絲聚合蛋白(FLG)mRNA表達 采用RT-PCR法檢測。用TRIzol法提取急性濕疹大鼠皮膚組織中的總RNA，并鑒定檢測樣本純度。FLG上游引物5′-CGAGGTGACCTGCACCAATGAC-3′，下游引物3′-CTGCTCCACCTTCGGGCCGACCCAC-5′，擴增長度186 bp；β-actin上游引物 5′-TCTAGGCACGTGGCAAGGTGTG-3′，下游引物 5′-TCATGAGGTAGTTGCCGTCAGG-3′，擴增長度125 bp。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，使用System SDS Software軟件計算循環(huán)閾值(Ct)，采用β-actin作為內(nèi)參照基因，以2-ΔΔCt作為FLG mRNA的表達水平。

1.3.4 蛋白酶激活受體2(PAR-2)表達 采用免疫組化染色法檢測。剪取大鼠右背部皮膚，放入固定液中，逐級乙醇固定，石蠟包埋并切片，采用免疫組化SP法檢測PAR-2表達，加入一抗PAR-2、二抗及陽性片。顯色復(fù)染封片，顯微鏡觀察。以細胞質(zhì)呈棕黃色或黃色表達為陽性判斷標準，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)半定量檢測積分光密度(IOD)，表示PAR-2表達。

2 結(jié)果

2.1 兩組皮膚外觀比較 正常組皮膚光滑無異常，模型組右背部造模區(qū)皮膚出現(xiàn)肉眼可見糜爛、紅腫、丘疹等急性濕疹癥狀。

2.2 兩組皮膚組織TEWL比較 正常組、模型組皮膚TEWL分別為(2.35±0.18)、(11.36±1.66)g/(h·m2)，模型組TEWL高于正常組(P<0.01)。

2.3 兩組皮膚病理改變 正常組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見任何炎癥充血水腫病理性改變，見圖1、2。模型組大鼠呈急性濕疹病理改變，如皮膚組織結(jié)構(gòu)模糊、水腫、充血及炎細胞浸潤等，見圖3、4。正常組、模型組病理評分分別為0、(2.20±0.63)分，模型組病理評分高于正常組(P<0.01)。

注：A為正常組，×100；B為正常組，×400；C為模型組，×100；D為模型組，×400。

2.4 兩組皮膚FLG mRNA比較 正常組、模型組FLG mRNA表達分別為6.2±0.68、0.79±0.19，模型組FLG mRNA表達低于正常組(P<0.01)。

2.5 兩組皮膚組織PAR-2蛋白表達比較 正常組中PAR-2陽性物質(zhì)染色顏色淺，分布少見。模型組中PAR-2陽性物質(zhì)染色深，分布廣泛。正常組、模型組PAR-2蛋白表達分別為0.153 4±0.002 2、0.170 8±0.011 5，模型組PAR-2蛋白表達高于正常組(P<0.01)。

3 討論

急性濕疹是臨床常見的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病，屬于遲發(fā)型超敏反應(yīng)。在早期或急性階段，臨床癥狀為紅斑、丘疹和小水皰，嚴重時出現(xiàn)滲出及糜爛。組織病理多表現(xiàn)為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞，層次不分明，可見變性、壞死、過度角化，棘層增厚，周圍組織有水腫及炎細胞細胞彌漫性浸潤等。急性濕疹發(fā)生的病因多樣，目前認為皮膚屏障功能的障礙是急性濕疹發(fā)病的關(guān)鍵。皮膚屏障功能的正常運作主要靠其最外層的角質(zhì)層細胞起“磚墻”的支架功能，其次其間的脂質(zhì)起“泥漿”粘連作用。任何改變角質(zhì)層結(jié)構(gòu)蛋白功能、脂質(zhì)正常代謝的因素都可能會導(dǎo)致皮膚屏障功能異常。前期研究發(fā)現(xiàn)，皮膚屏障功能異常是導(dǎo)致急性濕疹的發(fā)病的機制之一。但究竟是急性濕疹疾病中皮膚屏障的異常究竟是破壞了角質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)，還是脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，或者二者兼有尚需進一步證明。

DNCB多用于是設(shè)計經(jīng)典的急性濕疹模型，一般多刺激小鼠耳廓皮膚[1]。但有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠耳廓皮膚組織較薄，不能很好地模擬急性濕疹易發(fā)的軀干皮膚，故推薦使用大鼠背部替代小鼠耳廓[2]。大鼠背部皮膚實驗可用面積大，更利于急性濕疹皮損模型的大體觀察，如紅腫、丘疹、丘皰疹、糜爛滲出等現(xiàn)象。本研究使用DNCB刺激大鼠背部皮膚，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠DNCB刺激后，出現(xiàn)明顯的急性濕疹癥狀和符合急性濕疹的病理學(xué)變化，這與我們的前期研究一致[3]，表明本實驗成功造模急性濕疹大鼠。

研究發(fā)現(xiàn)，急性濕疹患者正常的皮膚屏障功能被破壞，最突出的現(xiàn)象是角質(zhì)層含水量減少，TEWL增高[4]。TEWL反映從皮膚表面蒸發(fā)的水分，代表表皮的滲透性屏障狀態(tài)，是評價皮膚功能的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，TEWL的增加與皮膚屏障功能障礙相關(guān)，而正常或減少的TEW可以作為是皮膚屏障完整或恢復(fù)的評價指標[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠皮膚角質(zhì)層明顯增厚，真皮層炎細胞浸潤增多，局部角質(zhì)層出現(xiàn)缺損，同時TEWL顯著增高，提示急性濕疹大鼠產(chǎn)生的機制之一可能是皮膚屏障功能破壞，角質(zhì)層水分的丟失增多，可能與TEWL的增加有關(guān)。

維持皮膚組織正常的新陳代謝除需角質(zhì)細胞外，也離不開角質(zhì)層的細胞間脂質(zhì)的參與。FLG由324個氨基酸構(gòu)成，存在于角質(zhì)細胞內(nèi)，在FLG的輔助下，角蛋白中間絲可進一步轉(zhuǎn)化為角蛋白纖維束[7]，即皮膚屏障中“磚塊”的主要成分，角質(zhì)細胞的支架結(jié)構(gòu)。FLG基因是編碼絲聚蛋白原的主要基因，急性濕疹患者可出現(xiàn)FLG活性降低，降低絲聚合蛋白的含量，從而阻礙角蛋白絲纖維束穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的建立，并減少其角質(zhì)化包膜中的生成，破壞其作為“磚墻”的支架作用[8,9]。絲聚蛋白的減少不僅會破壞其與角蛋白中間絲構(gòu)成的角質(zhì)細胞“骨架”的穩(wěn)定性，同時還可導(dǎo)致其下游產(chǎn)物天然保濕因子的減少，造成皮膚干燥，最終導(dǎo)致皮膚屏障功能異常。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組FLG基因表達低于正常組，提示模型組大鼠通過減少FLG基因表達，降低絲聚蛋白原的活性、降低絲聚合蛋白含量。

細胞間脂質(zhì)是一類疏水性細胞間質(zhì)，由表皮棘層細胞合成，包括神經(jīng)酰胺、不飽和脂肪酸及膽固醇等成分。其合成需由細胞質(zhì)內(nèi)存在的板層膜結(jié)構(gòu)釋放催化，該結(jié)構(gòu)即板層小體是一類特殊的細胞成分，內(nèi)涵豐富的脂質(zhì)合成前物質(zhì)和酶類。隨著表皮棘細胞的不斷上行，中層板層小體移動致顆粒層可與細胞膜相互結(jié)合，進而再排除到細胞間隙。表皮棘細胞繼續(xù)移行分化成復(fù)層板層膜結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為角質(zhì)層細胞；另一方面，被排出的脂質(zhì)前體則在酶的催化下，水解為脂質(zhì)成分[10]。蛋白酶激活受體(PARs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，其中PAR-2在人的皮膚上廣泛表達。PAR-2信號系統(tǒng)的上游信號是激肽釋放酶(KLKs)，而急性濕疹時KLKs呈過表達狀態(tài)。PAR-2活化后，導(dǎo)致板層小體數(shù)量減少，抑制脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致脂質(zhì)的“泥漿”黏合作用降低，破壞皮膚屏障功能[11]。此外，PAR-2可激活NF-κB 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)炎癥因子的釋放，促進肥大細胞脫顆粒加重急性濕疹炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[12,13]。急性濕疹發(fā)生時，PAR-2被激活，PAR-2可抑制角質(zhì)層細胞內(nèi)的板層小體的分泌，大量板層小體掩埋在角質(zhì)細胞內(nèi)難以釋放，可引起細胞間脂質(zhì)含量的減少，導(dǎo)致脂質(zhì)的“泥漿”黏合作用降低，破壞皮膚屏障功能[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠FLG基因表達降低，PAR-2含量卻增加，提示模型組大鼠可通過增加PAR-2的表達，抑制板層小體的分泌，抑制脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，破壞其間脂質(zhì)的功能，導(dǎo)致皮膚屏障功能難以發(fā)揮其正常的作用，誘發(fā)大鼠產(chǎn)生急性濕疹。

綜述所述，模型組大鼠發(fā)生急性濕疹的機制可能是通過降低FLG基因表達，并增加PAR-2含量，同時破壞角質(zhì)細胞及其間脂質(zhì)成分，從而增加TEWL，最終破壞正常的皮膚屏障功能。