龍惠萍，石勝良，王成志

(1 廣西醫(yī)科大學(xué), 南寧 530031; 2 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院; 3 廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，其病理特征主要是老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元缺失[1]。細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激、炎癥及細(xì)胞凋亡等多種因素共同參與了AD的形成[2]。β淀粉樣蛋白(Aβ)過度沉積誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是AD形成的主要原因之一[3]。此外，氧化應(yīng)激反應(yīng)又可促進(jìn)Aβ的合成[4]。研究表明，清除活性氧(ROS)對(duì)于緩解AD的發(fā)生發(fā)展具有確切的療效[5]。因此，減少Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是AD潛在的一種治療策略。目前針對(duì)AD的藥物大多數(shù)為緩解性藥物，尚無確切的能逆轉(zhuǎn)AD的藥物。青蒿素(ART)是一種倍半萜內(nèi)酯分子，近年研究發(fā)現(xiàn)其除具有抗瘧疾效用外，ART及其衍生物還具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。目前，關(guān)于ART對(duì)AD發(fā)病機(jī)制中Aβ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響尚不明確，相關(guān)研究較少。2018年1月～2019年1月，我們觀察了ART對(duì)AD模型細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激、炎癥因子及自噬的影響，為ART在AD防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞株由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院饋贈(zèng)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；青-鏈霉素雙抗購自碧云天公司；ART、 β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)購自Sigma公司；CCK8購自同仁公司；RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 PCR 試劑盒購自 TAKARA 公司；Cyto-ID細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33342購自ENZO Life Science；MitoSox Red線粒體超氧化物檢測(cè)試劑盒購自Eugene公司；IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自武漢華美公司。Aβ1-42用二甲基亞楓(DMSO)溶解，用高壓滅菌的雙蒸水稀釋至100 μmol/L。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BV-2 細(xì)胞在含有10%胎牛血清，1%青-鏈霉素雙抗的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置入37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞孵育箱中。每2天更換培養(yǎng)基1次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代。取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 ART有效濃度的確定 BV-2細(xì)胞(3×103/每孔)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ART(1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)繼續(xù)孵育24 h，采用CCK8法檢測(cè)ART對(duì)BV-2細(xì)胞的毒性，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用濃度。通過CCK8法檢測(cè)得到ART劑量范圍為0～8 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞無顯著的毒性反應(yīng)，因此選擇8 μmol/L作為ART的有效濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、Aβ1-42 組、ART組。正常對(duì)照組不做處理，Aβ1-42 組加入5 μmol/L的Aβ1-42制備AD細(xì)胞模型，ART組入8 μmol/L的ART及5 μmol/L的Aβ1-42，均干預(yù)24 h。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用 CCK-8 法。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，每個(gè)副孔加入10 μL的CCK8試劑并繼續(xù)培養(yǎng)2 h，每組設(shè)6個(gè)副孔，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔于450 nm下的吸光度(OD)值。

1.6 氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 采用MitoSox Red染色法。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，去掉培養(yǎng)基，根據(jù)說明書加入MitoSox Red和Hoechst 33342的混合液，在37 ℃下避光孵育細(xì)胞30 min，PBS洗3次后，使用熒光顯微鏡觀察MitoSox熒光強(qiáng)度并拍照。

1.7 炎癥因子水平檢測(cè) ①采用Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，參照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)定濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入上游及下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)(引物序列見表1)。采用 2-ΔΔct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。②采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。根據(jù)試劑盒說明，先加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品及50 μL待測(cè)樣品，然后加入50 μL生物素標(biāo)記的抗體。用封板膜封板后于37 ℃溫育1 h。再加入親和鏈酶素-HRP，37 ℃溫育30 min，每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min，迅速加入50 μL終止液，在450 nm波長處測(cè)定各孔的OD值。

表1 引物基本信息

1.8 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) ①采用 CYTO-ID染色法檢測(cè)自噬體的變化。將細(xì)胞接種于放置滅菌處理過的細(xì)胞爬片的12孔板中，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁生長在爬片上。處理細(xì)胞24 h后小心吸掉上清，用PBS洗2次，按 CYTO-ID Autophagy Detection Kit試劑盒說明書加入試劑染色劑CYTO-ID Green和細(xì)胞核染色劑Hoechst 33342，于37 ℃避光孵育30 min，再用PBS洗掉多余的染料，置于熒光顯微鏡下觀察 CYTO-ID綠色熒光強(qiáng)度。②采用Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白1(Beacline1)及微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3) mRNA水平。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，參照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)定濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入上游及下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)(引物序列見表1)。采用 2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較 正常對(duì)照組、Aβ1-42 組、ART組細(xì)胞活力分別為(100.00±5.12)%、(62.50±7.54)%、(88.56±4.57)%。Aβ1-42 組細(xì)胞活力低于正常對(duì)照組，ART組細(xì)胞活力高于Aβ1-42 組(P均<0.05)。

2.2 各組氧化應(yīng)激水平比較 正常對(duì)照組、Aβ1-42 組、ART組MitoSOX 熒光強(qiáng)度分別為(100.00±1.42)%、(208.46±4.11)%、(163.55±6.01)%。Aβ1-42 組熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照組，ART組熒光強(qiáng)度低于Aβ1-42 組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞及上清液中炎癥因子水平比較 Aβ1-42 組細(xì)胞及上清液TNF-α、IL-1β及IL-6 水平均高于正常對(duì)照組，ART組細(xì)胞及上清液TNF-α 、IL-1β及IL-6 水平均低于Aβ1-42 組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞及上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與Aβ1-42 組比較，﹟P<0.05。

2.4 各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 正常對(duì)照組、Aβ1-42 組、ART組細(xì)胞CYTO-ID綠色熒光強(qiáng)度相對(duì)水平分別為100.00%±0.43%、72.0%±5.22%、150.0%±4.90%，Aβ1-42 組的熒光強(qiáng)度低于正常對(duì)照組，ART組熒光強(qiáng)度高于Aβ1-42 組(P均<0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示，Aβ1-42組Beacline1、LC3 mRNA表達(dá)均低于正常對(duì)照組，ART組Beacline1、LC3 mRNA表達(dá)均高于Aβ1-42 組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞Beacline1、LC3 mRNA表達(dá)比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與Aβ1-42 組比較，﹟P<0.05。

3 討論

AD是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為異常。細(xì)胞外Aβ的異常聚集是AD 的主要病理特點(diǎn)，是老年斑的組成成分之一。此外，異常積累的 Aβ還可導(dǎo)致線粒體功能異常，如能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激等。在氧化應(yīng)激中，ROS的過量產(chǎn)生通過多種途徑損害各種生物分子的結(jié)構(gòu)和功能，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA[7]。研究表明，在AD 的發(fā)生發(fā)展過程中 Aβ與氧化應(yīng)激有密切的關(guān)系[8]，Aβ的沉積誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，氧化應(yīng)激反應(yīng)也可促進(jìn) Aβ的合成，兩者相互促進(jìn)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損害和功能失調(diào)的惡性循環(huán)[7]。隨著對(duì)抗氧化應(yīng)激機(jī)制的深入研究，抗氧化劑在AD臨床前期治療取得了一定的成功。目前常用的抗氧化劑包括硒、輔酶Q10、維生素C、維生素E。盡管目前基礎(chǔ)研究取得了很大的進(jìn)展，但AD的發(fā)病機(jī)制尚未得到明確的解釋，缺乏有效的治療方法?；贏RT對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，表明其可能對(duì) AD 有潛在的治療作用。本研究對(duì)ART對(duì)AD模型細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激、炎癥因子及自噬的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

ART是從黃花蒿莖葉中提取的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯。其被廣泛用于瘧疾的治療，此外還有抗寄生蟲、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)血腦屏障和免疫調(diào)節(jié)的作用[6, 9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ART在 AD 細(xì)胞模型中可抑制 Aβ1-42的產(chǎn)生[9]。ART可通過抑制 NF-κB 活性和 NALP3炎性體活化，延緩 APPswe /PS1dE9 轉(zhuǎn)基因小鼠的Aβ沉積進(jìn)程[10]。研究還發(fā)現(xiàn) ，ART 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞 PC12 具有營養(yǎng)和保護(hù)作用[11]，表明ART對(duì) AD 有潛在的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42組細(xì)胞活力低于正常對(duì)照組，而ART組的細(xì)胞活力高于Aβ1-42組，提示ART能改善Aβ1-42對(duì)BV-2細(xì)胞活性的抑制；Aβ1-42 組熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照組，ART組熒光強(qiáng)度低于Aβ1-42 組，表明ART能改善Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程[12]。自噬途徑可以降解功能受損的細(xì)胞器及異常聚集的蛋白質(zhì)。炎癥反應(yīng)是一種保護(hù)性反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)則會(huì)導(dǎo)致組織損傷和疾病；而自噬可通過降解DNA、活性氧族等內(nèi)源性刺激來抑制炎性小體聚集，降解IL-1β前體從而抑制IL-1β等促炎因子的分泌。研究表明，AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)mTOR表達(dá)升高，細(xì)胞自噬啟動(dòng)受阻，Aβ沉積增多[13]，但給小鼠腦內(nèi)注射mTOR的抑制劑，激活細(xì)胞自噬后，Aβ沉積減少，而且小鼠認(rèn)知水平也提高。Beclin1的表達(dá)是自噬體啟動(dòng)的標(biāo)志物，轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi) Beclin1表達(dá)水平下降，Aβ沉積增加[14]。還有研究表明，Aβ1-42能抑制PC-12細(xì)胞的自噬水平[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42組的細(xì)胞及上清液中炎癥因子水平均比正常對(duì)照組高，而ART組的炎癥因子較Aβ1-42組的低，表明ART抑制了Aβ1-42所致的BV-2細(xì)胞炎癥因子水平增加；Aβ1-42組CYTD-ID 綠色熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組減弱，且Beacline1、LC3 mRNA表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，但ART組的熒光強(qiáng)度及Beacline1、LC3 mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組及Aβ1-42組，表明ART激活了細(xì)胞的自噬水平。

綜上所述，ART能提高AD模型細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥因子分泌，其機(jī)制可能與ART增加自噬激活有關(guān)，這為ART應(yīng)用于AD早期炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的防治提供了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅為體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且只選取了單一濃度，后續(xù)有待進(jìn)一步選取多個(gè)濃度在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。