朱軍義， 馬繁華 ，徐亞輝

1.河南省南陽市中心醫(yī)院 (南陽473000);2.河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院)婦產(chǎn)科 (鄭州450003)

卵巢癌是一種惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性生殖器官，造成卵巢癌死亡的原因是癌細(xì)胞發(fā)生遷移，一旦發(fā)病，患者病死率極高，影響著女性的身體健康和心理健康[1]。龍葵堿(茄堿)主要存在于茄科植物中，例如馬鈴薯的塊莖以及龍葵全身，其中馬鈴薯芽中含量最高，毒性也最強(qiáng)[2]。AKT是一種臨床上較為常見的絲/蘇氨酸蛋白激酶,P-AKT則是磷酸化的AKT，又稱磷酸化蛋白激酶B(PKB)[3]。Cleaved Caspase-3為天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的早期階段發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。P53是一種至今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因。本文主要研究不同濃度的龍葵堿進(jìn)行調(diào)控p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)及其凋亡。

材料與方法

1 材 料

1.1 研究細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)所用的正常卵巢細(xì)胞、SKOV3卵巢癌細(xì)胞系購買自American Type Culture Collection(ATCC)。本文研究均獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

主要試劑及藥物：磷酸鹽緩沖液(PBS)(天根生化科技有限公司)；DMSO溶液(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。MTT試劑盒(鐘鼎生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(由美國賽默飛世爾科技有限公司提供)；鼠抗人p-AKT、Cleaved caspase-3和p53單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)；龍葵堿和胎牛血清(武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.2 主要儀器：倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀(均由美國貝克曼庫爾特公司提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞處理及分組：在超凈工作臺中配制細(xì)胞所用的培養(yǎng)基，其中胎牛血清的比例可控制在10～15%，雙抗(青霉素鏈霉素)的比例一般在1%左右，例：500 ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，需要加入胎牛血清56 ml和100×的雙抗5.56 ml。細(xì)胞用PBS：Nacl 4 g+Kcl 0.1 g+Na2HPO4×12H2O 0.71 g+KH2PO40.135 g用ddH2O定容至500 ml。方法實(shí)驗(yàn)分為模型對照組和龍葵堿處理組，種板后24 h換無血清培液時加入龍葵堿預(yù)處理24 h，細(xì)胞饑餓24 h后，更換無血清培液，再每天加入龍葵堿，48 h后提取細(xì)胞蛋白。共5孔，分別為正常對照孔(加入1 μl的PBS溶液和 1 μl的DMSO)、模型對照孔、龍葵堿15 μmol/L、龍葵堿10 μmol/L、龍葵堿5 μmol/L，分為正常對照組、模型對照組、龍葵堿15 μmol/L組、龍葵堿10 μmol/L組、龍葵堿5 μmol/L組。

2.2 倒置顯微鏡觀察SKOV3卵巢癌細(xì)胞形態(tài)：將SKOV3卵巢癌細(xì)胞傳代到6孔板中，加入25%的胰蛋白酶，消化5 min后，用離心機(jī)以2000 r/min的速度離心5 min后取上清液，用37 ℃的PBS緩沖液洗滌3 min，重復(fù)兩次后，再次用離心機(jī)以2000r/min的速度離心5 min后取上清液，接著加入濃度為95%的4 ℃乙醇，放置15 min，用離心機(jī)以1000 r/min的轉(zhuǎn)速分離，去除上清液，PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至為0.5～2.0×106/ml，去除細(xì)胞懸液后加入2 μl的Hoechst33258染液進(jìn)行染色10 min，最后置于載玻片上，加上蓋玻片，采用熒光顯微鏡對細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行詳細(xì)觀察。

2.3 MTT檢測增殖能力：將進(jìn)行培養(yǎng)后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，然后接種于96孔的培養(yǎng)板中，在每一個孔均加入細(xì)胞懸液90 μl，將三個不同濃度龍葵堿的培養(yǎng)細(xì)胞組的觀察時間定位24 h、48 h和72 h，每1個細(xì)胞組分別設(shè)置5個復(fù)孔，將不同濃度的龍葵堿分別加入每個細(xì)胞培養(yǎng)組中。參照組細(xì)胞在每孔中加入10 μl的培養(yǎng)液，然后按照三個不同濃度的龍葵堿細(xì)胞組的時間進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待所有細(xì)胞組培養(yǎng)到相應(yīng)的時間后，在每孔中加入MTT 20 μl繼續(xù)孵育4 h，將孔上的上清液仔細(xì)吸取，然后在孔中加入150 μl的DMSO，振蕩10 s，采用酶標(biāo)儀測定波長為570 mm的細(xì)胞組OD值，按照腫瘤細(xì)胞增殖率計(jì)算公式，增殖率%=(細(xì)胞組OD值/參照值-1)×100%，對HGC-27的細(xì)胞增殖率進(jìn)行計(jì)算。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：將五組細(xì)胞傳代到5孔板中，置于溫度為37 ℃，濃度為5%的二氧化碳的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，加入濃度為0.25 %的胰蛋白酶進(jìn)行消化，用離心機(jī)以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后收取細(xì)胞，然后使用PBS緩沖液洗滌3 min，重復(fù)洗滌2次，再次用離心機(jī)以2000 r/min的轉(zhuǎn)速分離后收集細(xì)胞，加入1MlPI染液，在避光的常溫環(huán)境中放置1 h后，然后用特異熒光標(biāo)記后，在鞘液包裹下高速流動中，流動期間會發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀檢測，利用發(fā)光信號測量儀檢測光子數(shù)值，到達(dá)檢測細(xì)胞凋亡的目的。

2.5 Western Blotting檢測p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表達(dá)：將采集到的細(xì)胞，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解35 min，將雙蒸水浸泡過的細(xì)胞置于EP管中保存，溫度為5 ℃，使用轉(zhuǎn)速為1000 r/min的離心機(jī)，離心處理20 min，分離上層血清，提取血漿，在-80 ℃環(huán)境中保存，待用。通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100V,電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37 ℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按(1∶1000)稀釋一抗，在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復(fù)清洗。最后將其僅在底物溶液中進(jìn)行顯色，采用BCA法測定蛋白濃度，嚴(yán)格按照BCA蛋白定量試劑盒操作說明書進(jìn)行，分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1 倒置顯微鏡觀察SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖能力變化 正常對照組細(xì)胞飽滿完整，大小均勻，排列緊密。卵巢癌細(xì)胞形態(tài)完整，輪廓清晰，細(xì)胞的大小一致，細(xì)胞漿飽滿，具有較強(qiáng)的遮光性，細(xì)胞貼壁良好，增殖性強(qiáng)；龍葵堿組細(xì)胞體積減小，輪廓不清晰，細(xì)胞皺縮，具有較差的遮光性，細(xì)胞易脫落，貼壁不好，懸浮的細(xì)胞增多(圖1)。正常對照組細(xì)胞和核模型對照組細(xì)胞細(xì)胞核大小保持一致，分布均勻；龍葵堿組細(xì)胞核固縮，核邊集和凋亡小體形成。隨著龍葵堿的濃度越高，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)越明顯(圖2)。

圖1 MTT增殖實(shí)驗(yàn)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的變化(Hoechst33258染色，×200)

圖2 不同濃度的龍葵堿作用于卵巢癌細(xì)胞染色后細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化(Hoechst33258染色，×200)

2 五組細(xì)胞在不同時間段細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖率比較 如表1所示，龍葵堿5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L組在24 h、48 h、72 h時間段對SKOV3卵巢癌細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖率模型對照組相比較，SKOV3卵巢癌細(xì)胞凋亡率逐漸升高，增殖率逐漸降低，正常對照組的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞增值率顯著低于其他各組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著時間的延長和藥物濃度的提高SKOV3卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用越來越顯著，與模型對照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 五組細(xì)胞p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表達(dá) 如表2所示，模型對照組p-AKT、Cleaved caspase-3的表達(dá)顯著低于龍葵堿5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L組，正常對照組低于模型對照組，龍葵組p53蛋白顯著高于模型對照組，正常對照組p53蛋白低于卵巢癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。龍葵堿5 μmol/L p-AKT、Cleaved caspase-3的表達(dá)顯著低于龍葵堿10 μmol/L、15 μmol/L組，p53蛋白表達(dá)高于其他兩組濃度，隨著龍葵堿濃度的升高，p-AKT、Cleaved caspase-3表達(dá)逐漸升高，p53蛋白表達(dá)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞在不同時間內(nèi)的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖率比較

注:與正常對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05

表2 各組細(xì)胞p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表達(dá)

注:與正常對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05

討 論

卵巢癌是女性生殖器官最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌排名第二位，嚴(yán)重的威脅著患者的生命安全[4]。早期卵巢癌無明顯癥狀表現(xiàn)，具有一定的隱匿性，缺乏特異性癥狀，當(dāng)診斷發(fā)現(xiàn)時，大多數(shù)患者已處于中晚期,錯過了臨床治療或手術(shù)的最佳時間，大約有80%以上的卵巢癌患者經(jīng)診斷發(fā)現(xiàn)病情時已經(jīng)出現(xiàn)了局部的蔓延，致使其死亡率一直高居?jì)D科惡性腫瘤之首[5]。卵巢癌患者5年生存率僅為30%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人體其他惡性腫瘤患者的5年生存率，如果能及早發(fā)現(xiàn)并接受治療，其5年生存率可能會達(dá)到90%左右，這也體現(xiàn)出了對卵巢癌癥狀早發(fā)現(xiàn)早治療的重要意義[6-7]。

腫瘤的惡性程度主要受其分化程度、病理類型的影響，在卵巢癌的不同時期，患者血清中的多種因子有著不同的分化水平，雖然卵巢癌缺乏特異性癥狀，但是通過檢測血清中的多種因子，可以對患者是否患有卵巢癌提供重要的臨床參考依據(jù)，以便使患者及早得到治療[8]。AKT是一種臨床上較為常見的絲/蘇氨酸蛋白激酶,P-AKT則是磷酸化的AKT，P-AKT具有一定的生物學(xué)活性,因?yàn)槠涞鞍桩a(chǎn)物與蛋白激酶A、蛋白激酶C具有高度的同源性,所以臨床上又稱之為蛋白激酶B(PKB)[9-10]。P-AKT能夠通過對人體各種下游分子產(chǎn)生作用,從而調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而對腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展產(chǎn)生影響[11]。本文研究結(jié)果顯示，在龍葵堿的作用下，SKOV3卵巢癌細(xì)胞中P-AKT的表達(dá)水平呈現(xiàn)出了上升趨勢，說明龍葵堿能夠調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中的P-AKT表達(dá)水平，從而抑制SKOV3卵巢癌的增殖能力，誘導(dǎo)其凋亡。

細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)是DNA的裂解，染色質(zhì)發(fā)生濃縮，細(xì)胞膜被活化，細(xì)胞發(fā)生皺縮，導(dǎo)致凋亡小體的形成。Caspase引起細(xì)胞凋亡的變化過程現(xiàn)在不太明確，相關(guān)機(jī)制有三種：凋亡抑制物，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白功能。Caspase是一組以天冬氨酸為底物的半胱氨酸蛋白酶家族，Caspase家族中大多數(shù)的成員在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用，Caspase家族基因的高表達(dá)能夠誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，Caspase-3是該家族的核心成員[12]。Caspase-3為天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，由酶原經(jīng)過酶解作用產(chǎn)生，在細(xì)胞凋亡的早期階段發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，所以臨床上被稱為死亡蛋白酶，是目前為止已知的細(xì)胞凋亡的最后執(zhí)行因子[13]。有學(xué)者研究表明[14-15]，Caspase-3通常以Pro-Caspase形式存在，而Pro-Caspase是無活性的Caspase-3前體，當(dāng)人體細(xì)胞受到凋亡信號或者其他外界有害物質(zhì)的刺激時，Pro-Caspase會進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3，即常說的裂解的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)，Cleaved Caspase-3具有成熟酶的性質(zhì)，通過酶切割特異性底物、DNA依賴性蛋白激酶、actin、lamin等參與細(xì)胞的凋亡過程，所以，臨床上常把Caspase-3的激活與否作為判斷細(xì)胞凋亡情況的重要指標(biāo)之一。如果Caspase-3蛋白的激活表達(dá)受到抑制，則細(xì)胞凋亡的情況會明顯得到減輕。Wang XM[16]等在其研究結(jié)論中表明，Cleaved Caspase-3在正常卵巢組織、卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率呈明顯下降趨勢，說明Cleaved Caspase-3在正常人體組織中的高表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而使細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定水平；但是Cleaved Caspase-3在腫瘤組織中的低表達(dá)，會使細(xì)胞增殖速度加快，細(xì)胞凋亡相對減少，從而促使卵巢癌的發(fā)病。本文研究結(jié)果顯示，在龍葵堿的作用下，SKOV3卵巢癌細(xì)胞中Cleaved caspase-3的表達(dá)水平呈現(xiàn)出了上升趨勢，說明龍葵堿能夠調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中Cleaved caspase-3的表達(dá)水平，從而促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而達(dá)到治療卵巢癌的目的。

P53是一種至今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因，其分為野生型和突變型兩種[17]。野生型P53蛋白能夠參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，可以有效抑制DNA的合成和復(fù)制，從而抑制細(xì)胞的增殖，而突變型的P53蛋白對DNA親和力下降，抑制細(xì)胞能力呈現(xiàn)出減弱的趨勢，從而失去了抗癌活性[18]。本文研究結(jié)果顯示，在龍葵堿的作用下，SKOV3卵巢癌細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的下降，說明龍葵堿能夠降低P53蛋白的表達(dá)水平，使P53蛋白恢復(fù)抗癌活性，從而達(dá)到治療卵巢癌的目的。

綜上所述，龍葵堿可能通過調(diào)控p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白的表達(dá)而抑制SKOV3卵巢癌的增殖能力，誘導(dǎo)其凋亡，其能力呈現(xiàn)濃度依賴。