李京濤,焦俊喆,魏海梁,閆曙光,李日向,常占杰,郭英君

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 (咸陽 712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) (咸陽 712046)；3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 (銀川 750001)

急性肝內(nèi)膽汁淤積屬于臨床難治的一類疾病，發(fā)病機制與肝細胞和(或)毛細膽管膽汁分泌障礙或肝內(nèi)膽管梗阻有關(guān)[1]。而新近研究發(fā)現(xiàn)，急性肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生發(fā)展與腸黏膜屏障的破壞明顯相關(guān)[2-4]。茵陳蒿湯是臨床上治療急性肝內(nèi)膽汁淤積的經(jīng)典方藥，此方可明顯改善肝病高黃疸患者肝功能、促進膽紅素代謝及緩解消化道不適癥狀[5-7]，但是否具有保護腸道黏膜屏障的作用，尚不清楚。本研究制備急性肝內(nèi)膽汁淤積SD大鼠模型，觀察茵陳蒿湯對大鼠腸道黏膜屏障及肝組織NF-κB表達的影響，從而探討茵陳蒿湯對腸道黏膜屏障保護機制，為中醫(yī)藥治療急性肝內(nèi)膽汁淤積提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物: 健康幼年雄性清潔級SD大鼠70只，日齡21 d，體重(80±20)g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，飼料隔日更換1次，自由攝取食水，環(huán)境室溫(22±1)℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物制備:茵陳蒿湯方藥均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購買和制備成凍干粉，符合中國藥典(2015版)要求，每克含生藥8 g，凍干粉密封保存于4 ℃ 冰箱內(nèi)備用，使用時100 ℃水溶解，使用時配置為劑量為1 g/ml的藥液。

1.3 主要試劑與儀器:ANIT(美國Sigma)；NF-κB ELISA試劑盒(南京森貝伽)；蘇木素、伊紅(陜西博達)；圖像采集系統(tǒng)：NIKON．ACT-1DXM1200日本尼康公司；光學(xué)顯微鏡：蔡司光學(xué)儀器(上海)公司；病理組織切片機(湖北泰維)，型號：TB-718EL。

2 實驗方法

2.1 實驗分組:70 只大鼠按照體重隨機分為正?？瞻捉M(10 只)，模型組(30 只)、中藥組(30 只)，其中中藥組和模型組又按灌服ANIT 后24 h、48 h、72 h 3個時間點分為3 組，每組10 只。

2.2 造模和給藥: 各組幼鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。造模方法：按50 mg/kg給予幼鼠一次性灌服1 % ANIT溶液，空白組按50 mg/kg灌服麻油，所有組灌胃前后12 h只進水不進食。造模前3 d予中藥組灌服茵陳蒿湯液(每次4 ml/kg，2次/d)至實驗結(jié)束，空白組和模型組每天同時灌服等量生理鹽水。造模后分24 h、48 h和72 h三個時間點處死幼鼠，空白組于48 h時間點全部處死。

2.3 標本采集:各組幼鼠腹腔注射6 %水合氯醛進行麻醉后處死，經(jīng)腹主動脈采血3 ml，擬行肝功能(ALT、ALP、GGT、TBIL)檢測。解剖小腸組織，并行環(huán)形切取，生理鹽水沖洗，盡量將組織平展，之后用4 %多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片。另取部分小腸組織置于2.5 %的戊二醛固定，送電鏡室觀察。

3 觀察項目及方法 一般情況觀察。肝功測定：將抽取的動脈血在冰上靜置30 min 后，按4000 r/min離心10 min，小心吸取上層清亮血清，全自動生化分析儀檢測肝功能(ALT、ALP、GGT、TBIL)數(shù)值。腸組織HE染色：取部分小腸組織，按照病理組織標準流程制作電鏡組織切片以及蘇木精-伊紅染色組織片，評估各組組織學(xué)形態(tài)變化。肝組織NF-κB檢測：取48 h時各組肝臟組織大小為15 mm×12 mm×5 mm置入EP管中，做肝組織勻漿，離心后提取上清液于EP管中，ELISA法檢測勻漿中NF-κB量，操作按照試劑盒說明進行。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計方法選擇One-WAY ANOVA方差分析法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組一般情況比較 空白組：在造模過程中毛色光亮，活動靈敏，進食量及尿色均良好。模型組：造模過程中毛色暗淡，活動遲鈍，進食量減少，尿色較空白組對比明顯加深。中藥組：與模型組比較，中藥組大鼠活動、進食量及尿色均明顯改善。

2 各組生化指標比較 如表1所示，與空白組比較，中藥組與模型組大鼠均出現(xiàn)ALT、ALP、GGT、TBIL的迅速升高。中藥組24 h與模型組24 h比較，ALT及TBIL明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在造模48 h后，中藥組與模型組ALT、TBIL均達到高峰，且兩組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模72 h后，中藥組與模型組ALT、TBIL均較同組造模48 h下降，且兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而在造模后24 h及48 h兩個時間點比較，中藥組的 ALP、GGT均低于模型組，但均無統(tǒng)計學(xué)差異；至造模72 h后，中藥組ALP、GGT指標改善明顯優(yōu)于同期模型組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 各組腸黏膜HE染色比較 空白組的腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，清晰完整，且絨毛排列整齊。造模24 h后，模型組腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，可見腸黏膜絨毛不同程度縮短、斷裂。與模型組對比，中藥組的腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞和絨毛結(jié)構(gòu)改變均較輕。造模后48 h及72 h，模型組出現(xiàn)較嚴重的腸黏膜絨毛改變，絨毛不同程度壞死、脫落，萎縮，排列雜亂，同時期中藥組較模型組病理改變較輕。

4 各組肝組織中NF-κB檢測比較 見表2。中藥組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組腸黏膜改變情況(HE染色，×100)

組 別nALT(U/L)ALP(μmol/L)GGT(U/L)TBIL(μmol/L)空白組48 h1040.90±3.67207.70±25.822.45±0.620.40±0.14模型組24 h101039.70±155.56559.30±53.296.73±0.8776.86±5.27模型組48 h101332.00±229.53772.30±51.377.53±1.06199.10±37.36模型組72 h10466.60±132.10784.20±50.528.41±0.80108.75±24.32中藥組24 h10689.80±107.22?505.40±58.566.48±0.7649.39±6.30?中藥組48 h10971.50±115.32?710.40±42.107.29±0.64140.49±26.32?中藥組72 h10206.20±74.49?713.10±31.69?7.35±0.62?59.45±12.89?

注：與同期模型組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠肝組織NF-κB的變化(ng/L)

注：與模型組比較，#P<0.01

討 論

急性肝內(nèi)膽汁淤積時，膽汁流入十二指腸發(fā)生障礙，造成腸黏膜屏障及腸道內(nèi)微生態(tài)的破壞，腸道大量內(nèi)毒素和細菌通過受損的腸黏膜屏障易位進入門靜脈系統(tǒng)并釋放出多種細胞因子和炎癥介質(zhì)，使得腸黏膜屏障解剖和功能的完整性發(fā)生進一步破壞，而淤膽造成的肝細胞炎癥損傷又進一步加重膽汁淤積，持續(xù)破壞腸道黏膜屏障，導(dǎo)致了病情的持續(xù)進展。本實驗發(fā)現(xiàn)與模型組對比，灌服茵陳蒿湯的大鼠病理學(xué)顯示小腸腸腔僅輕度擴大，小腸腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞和絨毛結(jié)構(gòu)改變均較輕。提示本方可能通過改善腸黏膜上皮細胞之間的緊密連接從而改善腸黏膜通透性，減輕腸組織損傷。

NF-κB是處于炎癥及免疫反應(yīng)風暴中心的關(guān)鍵細胞因子，其與多種細胞因子的合成與釋放密切相關(guān)[8]。胞漿中大量活化的NF-κB復(fù)合物進入細胞核內(nèi)，可以誘導(dǎo)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄與表達，同時還可刺激多種細胞因子的表達(如TNF-α、IL-2、IL-6)，而諸多細胞因子的過表達又可反向增強NF-κB的活化，造成持續(xù)的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)炎癥細胞因子“瀑布樣”效應(yīng)[9]。急性肝內(nèi)膽汁淤積時，腸道黏膜機械屏障完整性被破壞，腸道內(nèi)大量細菌及內(nèi)毒素發(fā)生移位，刺激肝臟NF-κB的持續(xù)高表達，NF-κB的高表達進一步導(dǎo)致肝功能的惡化甚至肝衰竭的發(fā)生。本次實驗結(jié)果顯示茵陳蒿湯可下調(diào)肝組織NF-κB的過度表達，其機制可能與茵陳蒿湯保護腸黏膜屏障，降低了腸道黏膜通透性，從而減少了肝組織NF-κB的表達。

茵陳蒿湯是臨床治療肝內(nèi)膽汁淤積濕熱證型最常用的方劑之一。方中茵陳蒿為君藥，清熱利濕、疏利肝膽;臣以梔子清泄三焦火熱，利濕退黃;而大黃具有通導(dǎo)濕熱以泄邪外出的功效，為佐藥。茵陳蒿湯可通過調(diào)控肝膽細胞膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達、促進膽紅素代謝、抑制氧化應(yīng)激等各方面治療急性肝內(nèi)膽汁淤積[10]。本研究提示茵陳蒿湯對急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠腸道黏膜的保護機制可能與上調(diào)腸黏膜機械屏障中的緊密連接相關(guān)蛋白，減少腸黏膜通透性，降低了肝臟NF-κB的表達有關(guān)。本研究證實了茵陳蒿湯治療急性肝內(nèi)膽汁淤積的有效性，為茵陳蒿湯在肝內(nèi)膽汁淤積中的應(yīng)用提供了實驗證據(jù)。