宋鵬 荊凱 魏鵬飛 孫永強(qiáng) 譚斌

(1河南省中醫(yī)院燒傷顯微修復(fù)科，河南 鄭州 450002；2河南省骨科醫(yī)院骨科；3中國人民解放軍第113醫(yī)院顯微手足外科)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨慢性退行性病變，以軟骨變性、骨質(zhì)增生、滑膜炎為主要病理特征〔1〕。關(guān)節(jié)炎主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜襯里成纖維細(xì)胞驅(qū)動，也被稱為成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLS)或B型滑膜細(xì)胞〔2〕。過度增生的FLS能夠通過局部產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及小分子炎癥介質(zhì)來促進(jìn)滑膜炎的初始階段〔2,3〕，因此，控制FLS異常增殖是治療OA的重要途徑〔4〕。血管緊張素Ⅱ具有兩種主要的G蛋白耦聯(lián)受體亞型，即血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)和血管緊張素Ⅱ 2型受體(AT2R)〔5〕。AT1R在培養(yǎng)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)-FLS和關(guān)節(jié)炎嚙齒動物模型的增生性滑膜中高度表達(dá)，其已經(jīng)被提出作為可能的治療靶點(diǎn)〔6,7〕，但對于AT2R的功能卻知之甚少。本研究將檢測AT2R在膝OA滑膜組織中表達(dá)；原代分離培養(yǎng)正常人FLS(H-FLS)和膝OA患者FLS(OA-FLS)，觀察炎癥因子對細(xì)胞中AT2R表達(dá)影響；干擾與激活OA-FLS中AT2R表達(dá)檢測其對IL-6 和IL-1β表達(dá)、核因子(NF)-κB活性及細(xì)胞增殖影響，以期闡明AT2R在OA發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本收集 收集河南省中醫(yī)院2014年2月至2015年12月經(jīng)手術(shù)治療膝關(guān)節(jié)OA患者54例，男24例，女30例，年齡48～65〔平均(55.4±4.1)〕歲，OA診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會制訂的膝關(guān)節(jié)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕，且OA患者均沒有接受任何緩解疾病的藥物治療。另取36例為無OA病史的創(chuàng)傷性截肢患者作為對照組，男22例，女14例；年齡45～58〔平均(51.6±5.7)〕歲。受試者均簽署書面知情同意書，研究方案獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2FLS細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 取健康和膝關(guān)節(jié)OA滑膜組織，用無菌磷酸鹽生理鹽水磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，眼科剪剪去多余脂肪、軟骨等組織并剪成糊狀，加入10倍體積的Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱消化2 h，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，將收集到的細(xì)胞接種至含有15%胎牛血清(Gibco公司)、2 mmol/L谷氨酰胺(Gibco公司)和1%青霉素-鏈霉素(Gibco公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至約80%融合度時(shí)，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，取第3～4代對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)〔4〕，培養(yǎng)3～4代H-FLS和OA-FLS細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈卵圓形位于細(xì)胞中央，為了進(jìn)一步鑒定分離得到的原代滑膜成纖維細(xì)胞，分別用CD14、CD90和Vimentin抗體對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行Western印跡檢測，結(jié)果如圖1所示，H-FLS和OA-FLS細(xì)胞中CD90、Vimentin蛋白表達(dá)陽性，CD14蛋白表達(dá)陰性，說明該細(xì)胞來源于中胚層，并具有成纖維細(xì)胞樣特點(diǎn)。分別記為H-FLS和OA-FLS細(xì)胞。

1.3Western印跡法 取適量3～4代H-FLS和OA-FLS細(xì)胞，用RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解30 min，取上清液至新的EP管中于4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)測定蛋白濃度，置于-80℃保存。將H-FLS和OA-FLS細(xì)胞分別用20 ng/ml的TNF-α(PeproTech公司)、10 ng/ml的IL-1β(PeproTech公司)及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞24 h〔8〕，提取蛋白進(jìn)行保存，并將各組依次記為TNF-α組、IL-1β組、TNF-α+IL-1β組，以不做任何處理細(xì)胞記為空白組。取20 μg蛋白樣品配置成上樣緩沖液，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進(jìn)行電泳分離，110 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用AT2R(Abcam公司)、GAPDH(碧云天生物技術(shù)有限公司)一抗孵育過夜，后用相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液進(jìn)行曝光顯影，Image J軟件分析各條帶蛋白相對表達(dá)量。

1.4沉默細(xì)胞中AT2R表達(dá) 取對數(shù)生長期OA-FLS細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞過夜長至60%融合度時(shí)，根據(jù)Lipofectamine?2000(ThermoFisher scientific)轉(zhuǎn)染試劑說明書將10 nmol/L的AT2R siRNA(siAT2R，Santa Cruz Biotechnology)或陰性對照(NC，Santa Cruz Biotechnology)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，按照1.3中步驟進(jìn)行Western印跡檢測AT2R蛋白表達(dá)。

1.5qPCR檢測IL-6、IL-1β表達(dá) 取1.2中分離得到的OA-FLS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染NC、siAT2R或用10 μmol/L的AT2R激動劑CGP42112A(Sigma公司)處理24 h，依次記為NC組、siAT2R組和AT2R激動劑組，以不做任何處理細(xì)胞作為空白組，使用TRIzol分離提取各組總RNA，Nanodrop 2000測定各組RNA濃度。采用Script Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，2×SYBR綠色熒光染料試劑盒上機(jī)檢測各組細(xì)胞IL-6、IL-1β表達(dá)，以18S為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中IL-6、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平。IL-6引物：正義鏈：5′-AAAGAGGCACTGGCAGAAAA-3′，反義鏈：5′-TTTCACCAGGCAAGTCTCCT-3′；IL-1β引物：正義鏈：5′-TTCTTCGACACATGGGATAACG-3′,反義鏈：5′-TCCCGGAGCGTGCAGTTCA-3；18S引物：正義鏈：5′-CCGCAGCTAGGAATAATGGAATA-3′，反義鏈：5′-TCTAGCGGCGCAATACGAAT-3′。

圖1 Western印跡法檢測H-FLS和OA-FLS細(xì)胞中蛋白表達(dá)

1.6熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 人含有NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)的IL-6啟動子熒光素酶報(bào)告基因載體pIL-6-promoter-luc，利用點(diǎn)突變試劑盒(Takara公司)將IL-6啟動子區(qū)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)突變構(gòu)建pIL-6-promoter-luc-Mut質(zhì)粒。取對數(shù)生長期OA-FLS細(xì)胞、NC細(xì)胞、siAT2R細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞過夜長至60%融合度時(shí)，根據(jù)Lipofectamine?2000(Thermo Fisher scientific公司)轉(zhuǎn)染試劑說明書將0.25 μg pIL-6-promoter-luc-WT/Mut和0.125 μg phRL-null(Promega公司)共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，分別記為對照組、NC組、siAT2R組，以AT2R激動劑CGP42112A(Sigma公司)處理24 h作為AT2R agonist組。根據(jù)雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測試劑盒(Promega公司)檢測各組相對熒光素酶活性。

1.7細(xì)胞增殖檢測 取2×104個(gè)OA-FLS細(xì)胞接種至96孔板中培養(yǎng)過夜，后將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，并在含0.2%胎牛血清的RPMI1640中再溫育24 h。將FLS在含有TNF-α、CGP42112A培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，記為TNF-α組和AT2R激動劑組，以不做任何處理細(xì)胞作為空白組，以轉(zhuǎn)染siAT2R為siAT2R組。使用MTT進(jìn)行細(xì)胞增殖測定，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1對照組與OA組AT2R表達(dá) OA組AT2R蛋白表達(dá)量(2.11±0.42)較對照組(1.02±0.31)顯著增加(t=3.617，P=0.022)，提示AT2R可能與OA發(fā)生有關(guān)。見圖2。

1、2、3：對照組；4、5、6：OA組圖2 對照組與OA組AT2R表達(dá)

2.2炎癥因子對OA-FLS細(xì)胞中AT2R表達(dá)及增殖影響 與空白組相比，TNF-α組、IL-1β組及IL-1β+TNF-α組H-FLS細(xì)胞及TNF-α組、IL-1β+TNF-α組OA-FLS細(xì)胞中AT2R表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，表明膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥微環(huán)境可導(dǎo)致滑膜組織AT2R表達(dá)增加。見圖3，表1。

1～4：H-FLS細(xì)胞；5～8：OA-FLS細(xì)胞；1、5：空白組；2、4：IL-1β組；3、7：TNF-α組；4、8：IL-1β+TNF-α組圖3 炎癥因子TNF-α、IL-1β對H-FLS和OA-FLS中AT2R表達(dá)影響

組別H-FLSOA-FLS空白組0.07±0.010.42±0.03IL-1β組0.13±0.011)0.43±0.03TNF-α組0.28±0.021)0.52±0.041)IL-1β+TNF-α組0.39±0.041)0.75±0.081)F值114.68228.816P值0.0000.000

與空白組相比：1)P<0.05

2.3干擾和激活A(yù)T2R對OA-FLS中炎癥因子表達(dá)影響 siAT2R組AT2R蛋白表達(dá)(0.21±0.02)較NC組(0.46±0.04)明顯降低(t=9.683，P=0.001)，見圖4。與NC組相比，siAT2R組IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而AT2R激動劑組IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4AT2R對OA-FLS細(xì)胞中NF-κB 信號通路影響 與對照組相比，TNF-α組、siAT2R組NF-κB p65活性顯著增加(P<0.05)，AT2R激動劑組NF-κB p65活性明顯被抑制(P<0.05)；而將IL-6啟動子上NF-κB p65結(jié)合位點(diǎn)突變構(gòu)建的pIL-6-promoter-luc-Mut載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，TNF-α、siAT2R、AT2R激動劑各組熒光素酶活性均無明顯變化(P>0.05)。見圖5，表3。結(jié)果表明，激活A(yù)T2R能夠抑制NF-κB對炎癥因子IL-6誘導(dǎo)作用。

圖4 Western印跡法檢測OA-FLS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA后AT2R蛋白表達(dá)

組別IL-6IL-1β空白組1.00±0.031.00±0.02NC組0.98±0.041.02±0.03siAT2R組1.32±0.081)1.35±0.061)AT2R激動劑組0.41±0.041)0.45±0.031)F值163.762287.793P值0.0000.000

與NC組相比：1)P<0.05

圖5 NF-κB在IL-6啟動子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)

組別pIL-6-promoter-luc-MutpIL-6-promoter-luc-WT對照組1.00±0.121.57±0.18TNF-α組1.12±0.146.12±1.031)siAT2R組1.03±0.094.03±0.941)AT2R激動劑組0.99±0.110.71±0.081)F值0.77536.380P值0.5400.000

與對照組相比：1)P<0.05

2.5激活A(yù)T2R對OA-FLS細(xì)胞增殖影響 與空白組相比，在48 h、72 h時(shí)TNF-α組、siAT2R組OA-FLS細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而AT2R激動劑組細(xì)胞增殖能力被顯著抑制(P<0.05)。見表4。

表4 各組OA-FLS細(xì)胞增殖能力比較

與空白組相比：1)P<0.05

3 討 論

OA是常見的關(guān)節(jié)疾病之一〔9〕，主要表現(xiàn)是關(guān)節(jié)疼痛和活動不靈活，多發(fā)生于老年人群，研究表明，OA與關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔10〕。AT2R在多種疾病中起重要作用，如心血管疾病、高血壓、免疫疾病等。苗莉等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，AT2R基因可能抑制血管損傷后骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)及新生內(nèi)膜的過度增生。寇學(xué)俊等〔12〕研究報(bào)道，AT2R基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓患者動態(tài)血壓參數(shù)有關(guān)。唐兵等〔13〕研究表明，AT2R能夠抑制樹突細(xì)胞成熟誘導(dǎo)的局部免疫炎性反應(yīng)，推測AT2R可能介導(dǎo)抑制動脈粥樣斑塊的進(jìn)展。此外，有研究報(bào)道AT2R在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中表達(dá)，TNF-α或IL-1β促炎性細(xì)胞因子刺激牛軟骨細(xì)胞中也表達(dá)AT2R，而在未刺激的細(xì)胞中則無此現(xiàn)象〔14,15〕。有研究也表明AT2R可能介導(dǎo)與AT1R相反的作用，其可能主要發(fā)揮抗炎作用〔16～19〕。然而，到目前為止，尚無體外研究AT2R在FLS細(xì)胞中的表達(dá)和可能功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康患者滑膜組織相比，OA患者滑膜組織中AT2R表達(dá)顯著增加。值得注意的是，用TNF-α和IL-1β處理不僅能夠促進(jìn)OA-FLS中AT2R的表達(dá)，而且還能誘導(dǎo)其在H-FLS中表達(dá)。本研究表明，促炎性刺激可以誘導(dǎo)和維持FLS中AT2R的表達(dá)，這與先前研究結(jié)論相一致，在體內(nèi)AT2R在健康組織中僅微弱表達(dá)，而當(dāng)組織損傷情況下AT2R表達(dá)強(qiáng)烈明顯增加〔20〕，提示AT2R與OA進(jìn)展密切相關(guān)。

細(xì)胞因子是參與免疫和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞所分泌的、能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子蛋白和多肽〔21〕，其廣泛存在于機(jī)體各種組織中，它們從分子水平上對多種疾病的發(fā)生發(fā)展起較為重要的調(diào)節(jié)作用〔22,23〕。有研究者發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)功能的喪失與血清及組織中促炎性細(xì)胞因子的高濃度有關(guān)〔14〕。Pattacini等〔6〕研究表明，血管緊張素Ⅱ能夠通過AT1R依賴的NF-κB通路激活來保護(hù)RA-FLS免于凋亡。本研究證實(shí)OA-FLS中AT2R表達(dá)增加，這進(jìn)一步促使我們來闡明AT2R在調(diào)節(jié)這些細(xì)胞功能表型的潛在作用。因此，本研究探討了AT2R功能獲得或喪失是否會影響OA-FLS中促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)及NF-κB激活，發(fā)現(xiàn)在OA-FLS細(xì)胞中敲減AT2R明顯促進(jìn)了IL-6、IL-1β表達(dá)，相反AT2R激動劑CGP42112A處理后IL-6、IL-1β表達(dá)顯著被抑制，這與先前在糖尿病危害動脈粥樣硬化、早期糖尿病腎炎、內(nèi)皮炎癥及巨噬細(xì)胞中研究結(jié)論一致，AT2R可能主要發(fā)揮抗炎作用〔16～19〕。用AT2R激動劑治療OA-FLS顯著降低NF-κBp65的DNA結(jié)合活性，這與Rompe等〔24〕通過激活A(yù)T2R能夠阻斷原代人和小鼠真皮成纖維細(xì)胞中NF-κB來降低TNF-α誘導(dǎo)的IL-6水平的研究結(jié)論一致。此外，MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲減AT2R明顯促進(jìn)了細(xì)胞增殖，而AT2R激動劑則明顯抑制了OA-FLS增殖能力。

綜上所述，本研究證明AT2R在膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中高表達(dá)；促炎因子可刺激FLS中AT2R 顯著上調(diào)；用選擇性激動劑激活A(yù)T2R能夠抑制OA-FLS中促炎因子IL-6、IL-1β表達(dá)，抑制細(xì)胞OA-FLS增殖，闡明了一種膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的正反饋機(jī)制，提示AT2R激動劑可能代表了一種潛在的緩解OA滑膜炎癥的新型治療策略，但是還需要進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究。